华支睾吸虫sPLA2相互作用蛋白质的筛选鉴定及其功能研究

来源 :中山大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yibola2008
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华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)是一种致病性吸虫,主要由食入感染华支睾吸虫囊蚴的“鱼生”感染,成虫寄生于人及其他哺乳动物肝胆管系统,虫体的机械性刺激和分泌/排泄物可以刺激胆管上皮及结缔组织增生,引起胆道炎症、胆管阻塞、甚至胆管癌、肝硬化、肝癌,全世界均有患者发病和死亡,但主要流行于东亚地区包括中国、韩国和越南。目前中国有1300万患者左右。近年来,华支睾吸虫病发病呈上升趋势,已成为我国流行最广、危害最大的食源性寄生虫病之一,2005年广东省已将其列为重点防治的三大地方病之一,2006年卫生部已将其列为重点防治的寄生虫病。对华支睾吸虫引起肝纤维化和肝硬化的分子机制进行深入研究,对防治华支睾吸虫病具有重要的意义。肝纤维化是由于肝细胞外基质(ECM)合成和降解失衡,ECM过度沉积而发生的,肝星状细胞(HSC)活化、增殖是肝纤维化的关键事件。已有实验证明华支睾吸虫分泌排泄产物(Cs ESP)通过使肝星状细胞活化增殖导致肝纤维化产生,还可使胆管上皮细胞(BEC)增生、癌变致胆管癌的发生,其中Cs ESP的成分之一分泌型磷脂酶A2(s PLA2)能引起HSC的活化增殖,这种作用不能被其酶活性的作用底物卵磷脂所阻断,而只能被其特异性抗体所阻断,显示Css PLA2发挥使HSC活化增殖的作用不是通过酶活性而是通过结合相关受体实现的,但与其作用的受体蛋白及其活化HSC的具体分子机制仍不清楚。因此探究华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2(Css PLA2)相互作用的蛋白质及其相关的信号通路,对进一步了解华支睾吸虫引起肝纤维化的有重要意义。研究目的和意义基于探究和华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2(Css PLA2)相互作用的蛋白质及与其相互作用相关的信号通路,对进一步了解该蛋白分子在华支睾吸虫引起肝纤维化中的作用有重要意义。本课题以下列研究为目标,初步探讨Css PLA2相互作用蛋白质的筛选与其功能:(1)酵母双杂交初步筛选出与Css PLA2相互作用蛋白质;(2)对筛选出与Css PLA2相互作用蛋白质进行免疫共沉淀、GST Pull-down等体外实验进一步验证;(3)探究Css PLA2及其相互作用蛋白质结合后对人肝星状细胞系LX2细胞效应及其可能涉及的相关细胞信号通路。研究方法1.利用酵母双杂交筛选与Css PLA2相互作用的蛋白质。构建诱饵载体(p GBKT7-s PLA2),并转化到酵母菌Y2HGold,诱饵蛋白自身激活测试、毒性测试及表达验证后,含诱饵载体的酵母Y2HGold与含人肝c DNA文库载体(p GADT7)的酵母Y187进行杂交(mating),杂交后的产物涂布于营养缺陷型培养基生长,选取生长出的酵母菌落,扩大培养提取质粒后PCR产物送测序。对测序结果进行初步分析,筛选出和Css PLA2直接相互作用蛋白质。2.免疫共沉淀(CO-IP)验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用将Css PLA2及相互作用候选蛋白质TM7SF3分别克隆到真核表达载体p EGFP和pc DNA6,构建好的重组载体利用Lipofectamine 2000瞬时共转染转染到293T细胞,以单独转染重组Css PLA2表达载体和重组相互作用蛋白质表达载体作为对照组。转染成功后293T细胞以RIPA液裂解,细胞裂解液与Protein A琼脂糖珠在4°C共孵育过夜后离心沉淀后洗涤,再用抗c-Myc抗体及抗PLA2抗体分别进行Western blotting分析。3.GST Pull-down验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用将Css PLA2及相互作用蛋白质TM7SF3分别克隆到表达载体p MAL-c2x和p GEX-4T-1,在大肠杆菌中表达,用亲和层析法纯化目的蛋白,并做SDS-PAGE分析。带MBP标签的Css PLA2和带GST标签的蛋白质GST-TM7SF3混合物用Amylose resin进行亲和层析纯化,以MBP蛋白、GST蛋白分别与MBP-Css PLA2混合后在Amylose resin中亲和层析纯化的产物作为对照组,纯化后的产物均用抗GST抗体进行Western blotting分析。4.对Css PLA2相互作用蛋白质在LX2细胞上进行免疫组化定位免疫组化法测定Css PLA2相互作用蛋白质TM7SF3在LX2细胞上的细胞定位,LX2细胞与或不与抗TM7SF3抗体孵育后经苏木素染色,洗涤后观察细胞染色情况及黄褐色颗粒分布位置。5.检测Css PLA2及筛选出的蛋白质对LX2细胞的作用及其涉及的相关信号通路LX2细胞分别用重组Css PLA2蛋白、重组Css PLA2及抗TM7SF3抗体混合物及PBS孵育24h后,CCK-8法分别测定LX2细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测TGF-β、ERK、JNK and NF-κB等与肝纤维化相关的信号通路的表达变化。研究结果1.酵母双杂交筛选与Cs PLA2相互作用的蛋白质酵母双杂交初步筛选出5个可能与Css PLA2相互作用的蛋白质,其中1个定位于细胞膜(TM7SF3)、1个为分泌蛋白质(hemopexin,isoform CRA_a)、3个定位于线粒体(metallothionein-2、aminoacylase-1 isoform b、cytochrome c oxidase subunit I)。排除定位于线粒体不能与Css PLA2直接结合的蛋白质以及分泌游离于血液中的蛋白质,选定有可能与Css PLA2直接作用的定位于细胞膜上的蛋白TM7SF3进行进一步验证。2.CO-IP验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用重组后Css PLA2和TM7SF3蛋白均能在293T细胞中表达。单独转染p EGFP-Css PLA2的293T细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后只能被抗PLA2抗体识别,单独转染pc DNA6-TM7SF3细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后既不能被抗c-Myc抗体识别,也不能被抗PLA2抗体识别,只有p EGFP-Css PLA2和pc DNA6-TM7SF3共转染后的293T细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后,能被抗c-Myc抗体和抗PLA2抗体同时识别,显示Css PLA2和TM7SF3蛋白存在相互作用。3.GST Pull-down验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用MBP-Css PLA2和GST-TM7SF3在大肠杆菌中表达,相对分子质量分别约为42k Da和70k Da。只有MBP-Css PLA2和GST-TM7SF3蛋白质混合物经只能沉积含MBP标签蛋白Amylose resinpull down后的产物能被抗GST抗体识别,Css PLA2和TM7SF3蛋白存在相互作用。4.对Css PLA2相互作用蛋白质在LX2细胞上进行免疫组化定位免疫组化法测定Css PLA2相互作用蛋白质TM7SF3在LX2细胞上的细胞定位,LX2细胞与或不与抗TM7SF3抗体孵育后经苏木素染色,洗涤后观察细胞染色情况及黄褐色颗粒分布位置。只有与抗TM7SF3抗体孵育后LX2细胞显现棕黄色,且黄褐色颗粒主要集中于细胞膜上。5.检测Css PLA2及筛选出的蛋白质对LX2细胞的增殖作用及有关的信号通路CCK-8检测结果显示Css PLA2孵育24h后相比PBS对照组OD450结果显示PBS孵育组LX2细胞OD450约为1.2,Css PLA2孵育组LX2细胞OD450约为1.5,LX2细胞增殖率较PBS组升高了25%,而Css PLA2和抗TM7SF3抗体混合物孵育组LX2细胞OD450约为1.0,细胞增殖率较Css PLA2孵育组降低了33%。结果显示Css PLA2能够使LX2细胞增殖,抗体阻断TM7SF3后Css PLA2对LX2细胞增殖作用减弱,间接验证了TM7SF3和Css PLA2共同作用使LX2细胞增殖。抗TM7SF3抗体阻断TM7SF3后,Css PLA2对LX2细胞活化增殖作用受抑制。Css PLA2孵育LX2细胞24h后,相比空白对照组,肝纤维化相关信号通路,包括ERK、JNK、NF-k B、TGF-Smad等通路关键基因表达水平也上调,抗TM7SF3抗体阻断TM7SF3后,相比Css PLA2孵育LX2细胞上述通路关键基因表达水平下调。结论1.酵母双杂交筛选出和Css PLA2相互作用的人蛋白质TM7SF3等。2.免疫共沉淀、GSTPull-down进一步验证Css PLA2与人TM7SF3的相互作用。3.免疫组化对TM7SF3在人肝星状细胞系LX2细胞上定位,主要位于细胞膜。4.通过TM7SF3抗体阻断等反向验证Css PLA2致肝纤维化所涉及的相关信号通路,包括ERK、JNK、NF-k B、TGF-Smad等通路。
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