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目的:因先天畸形、肿瘤切除、创伤和感染等多种原因导致的骨缺损严重影响患者的身体和心理健康。临床上治疗大段骨缺损的方法十分有限,已成为骨科及颌面外科医生所面对的最大挑战。尽管目前自体骨移植被认为是骨缺损修复的金标准,但供区感染、骨量有限、二次手术创伤等不足极大地限制了自体骨移植的临床应用。同种异种骨和异体骨作为自体骨的替代品近些年广泛应用于临床,但仍存在许多不足,如感染、免疫排斥风险和伦理等问题。因此,采用组织工程技术构建具有成骨诱导活性的人工骨材料被认为是骨缺损修复的最佳方法。丝素蛋白(Silk fibroin,SF)和β-磷酸三钙(β-calcium phosphate,β-TCP)多孔支架材料,能分别模拟天然骨的有机和无机成分,具备良好的生物相容性、无免疫原性和可控的降解性,已被广泛应用于临床和基础研究。然而临床实践和相关研究表明,单纯SF或β-TCP材料的成骨能力很弱或者骨再生速度缓慢,与周围骨组织整合性不足,无法满足于修复骨缺损的需要。生长因子,作为组织工程技术三要素之一,可以调节细胞的多种生物学行为,并可以与体内其他生物活性分子发生协同或者拮抗作用,对骨组织再生起到至关重要的作用。由于生长因子多为水溶性蛋白,存在稳定性差、容易降解、无法与骨修复周期相匹配等问题,因此需要合适的载体在时间和空间上精确调控生长因子的释放,并通过在支架材料中固定生物活性分子促进细胞粘附、增殖和分化等,为修复骨缺损提供新思路。此外,单一活性分子或者多种活性分子简单混合的成骨效果十分有限,许多研究已经证实当多种生物活性分子固定在支架材料中,其释放的时间和顺序及细胞的反应是非常重要的。本研究旨在通过表面改性技术改善支架SF/β-TCP材料的物理化学性能,赋予支架材料表面良好的微纳结构,使其具备骨传导性和骨诱导性,达到修复骨缺损和引导骨再生的目的。因此我们首先制备不同SF和β-TCP比例的多孔支架,优化其理化和生物学性能,近而采用氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)-多聚赖氨酸(Polyl-lysine,PLL)复合物(GO-PLL)修饰携带白蛋白纳米颗粒,并可控携带和有效缓释骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),并验证其对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用。最后本研究通过GO-PLL复合物对SF/β-TCP支架材料进行多功能修饰,使其负载促进细胞粘附的纤连蛋白(Fibronectin)和具有成骨诱导分化功能的BMP-2,并探讨多种释放模式对BMSCs粘附、增殖和分化的影响。方法:1、采用冷冻干燥方法制备不同比例的SF/β-TCP多孔支架(SF/β-TCP=1/0,2/1,1/1,1/2),并通过场发射扫描电镜、X线衍射、衰减全反射-傅立叶变换红外光谱等表征其理化性能(形貌、孔径、孔隙率、溶胀性、降解性、力学强度和体外矿化能力),采用CCK-8法检测BMSCs在复合支架上的增殖能力,通过碱性磷酸酶活性评估BMSCs在复合支架上的成骨分化能力,探讨不同支架的生物相容性和成骨诱导活性,确定SF/β-TCP最佳比例支架,为后续研究做准备。2、采用去溶剂法制备白蛋白纳米颗粒(包裹BMP-2活性蛋白),制备不同比例的GO-PLL聚合物(GO/PLL=1/1,1/5,1/10),并通过自组装技术修饰白蛋白纳米颗粒,通过透射电子显微镜、扫描电子显微镜、粒径分析仪动态光散射、衰减全反射-傅立叶变换红外光谱等对其物相组成和微观形貌进行检测和分析。不同时间点检测GOPLL/BMP-2纳米颗粒中BMP-2的释放量,CCK-8和活死染色检测GO-PLL/BMP-2对BMSCs增殖情况的影响,通过碱性磷酸酶和茜素红染色评估GO-PLL/BMP-2对BMSCs碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化能力的。3、将FN和BMP-2通过GOPLL复合物单独或共同固定到SF/β-TCP多孔支架中,检测不同时间点FN和/或BMP-2的释放量,分析其释放曲线,不同方式固定的FN和BMP-2活性分子的复合支架材料与BMSCs共培养,通过扫描电子显微镜观察多孔材料表面的BMSCs形貌,通过罗丹明-鬼笔环肽对细胞进行染色,并在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间点BMSCs的骨钙素和I型胶原的mRNA表达,免疫荧光技术检测I型胶原的蛋白表达。结果:1.、通过冷冻干燥方法制备具有合适的孔径和孔隙率的多孔支架,随着β-TCP的比例增加,支架的孔径和力学强度逐渐增加,孔隙率无明显变化;SF/β-TCP可以促进磷灰石晶体成核,在材料表面形成矿化层,其中SF/β-TCP(1/2)的矿化能力最强;所有SF/β-TCP均具有良好的生物相容性,可以促进BMSCs粘附和增殖,但BMSCs在SF/β-TCP支架上的碱性磷酸酶活性无显著差异,显著低于阳性对照组,说明支架材料的成骨诱导活性较差。2、制备的GO粒径大约100 nm,电位为-38.6±3.7mv,经过共价结合得到的GO-PLL复合物的粒径和电位随着PLL的比例增加而增大,GO-PLL修饰BSA纳米颗粒形态良好,分布均匀,GO-PLL(1/1)/BSA和GOPLL(1/5)/BSA粒径尺寸相差不大,均小于GO-PLL(1/10)/BSA。BMSCs与GOPLL/BSA共培养,每个时间点的细胞活性均大于95%,说明GO-PLL/BSA纳米颗粒具有良好的生物相容性。与包裹BMP-2的纳米颗粒相比,经GO-PLL自组装修饰的BMP-2纳米颗粒均可以在体外可控缓释BMP-2,且前三天释放量相差不大,从第4天到第10天,GO-PLL(1/1)/BMP-2释放速率和释放量高于另外两组。通过缓释BMP-2,GO-PLL/BMP-2可以显著提高BMSCs碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化情况。3、体外释放结果表明,不同方法单一固定的FN释放速率无明显差异,GO-PLL/FN的累计释放量和释放周期优于物理吸附FN;单一固定BMP-2纳米微球(BSA-BMP-2)和BMP-2的释放曲线无明显差异;此外,与物理吸附FN和BMP-2相比,经GO-PLL修饰的多孔支架中,FN和BMP-2-nps在3-4天内有个突释的现象,且FN先于BMP-2释放,BMP-2的累计释放量更大,释放时间更长,可长达28天。扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜结果证实共固定FN和BMP-2可显著促进BMSCs的粘附和铺展,CCK-8和活死染色结果说明复合材料具有良好的生物相容性,其中GO-PLL/FN+BMP-2可以显著提高BMSCs在材料表面的增殖能力,RTPCR和免疫荧光结果证实与单一复合FN或BMP-2相比,共固定FN和BMP-2能够显著提高BMSCs骨钙素和I型胶原蛋白mRNA或蛋白的表达水平,其中通过GO-PLL修饰的复合支架可以更有效有效促进BMSCs的成骨分化,具有最高的成骨诱导活性。结论:1、当SF和β-TCP比例为1:2时,SF/β-TCP支架材料具有良好的理化性能和生物相容性,但是成骨诱导活性不足。2、本研究制备粒径尺寸合适的GO-PLL复合物,并通过自组装技术修饰白蛋白纳米颗粒,具有良好的生物相容性,并可以可控携带并有效缓释BMP-2生物活性蛋白,促进BMSCs成骨分化。3、通过GOPLL修饰无细胞的SF/β-TCP复合支架可以可控有序释放FN和BMP-2,显著促进BMSCs的粘附、增殖和成骨分化,具有良好的生物相容性和成骨诱导活性,对生物医用支架材料发挥长期疗效具有积极作用,在整形外科和骨科等领域具有良好的应用价值。