类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是以慢性、进展性和侵蚀性关节炎为特点的一类自身免疫性疾病,最终表现为骨质的破坏、关节的畸形,致残率极高。目前RA的治疗以免疫抑制剂为主,但治疗的副作用较大。已知CD4+CD25+Foxp3+的天然调节性T细胞(Natural Ocurring Regulatory T Cells, nTregs)数量的减少和/或功能的降低与RA的发病有关。有学者发现,在RA小鼠模型输注nTregs可以预防关节炎的发生和减轻关节炎的严重程度。但是,在已发病的RA经典小鼠模型——胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)中,即使额外输注nTregs,对关节炎也没有起到改善作用。近来,本研究小组发现,TGF-β诱导的调节性T细胞(Induced Regulatory T cells, iTregs)不仅具有与nTregs相同的表型和抑制关节炎发病的功能,而且在体外促炎症因子白介素-6 (Interleukin 6, IL-6)的作用下能表现出更强的稳定性和对效应性T淋巴细胞的抑制力。因此,本论文第一部分的研究旨在比较nTregs和iTregs对CIA预防与治疗作用的差异。关节破坏是RA患者最常见的症状和转归,破骨细胞在RA患者的骨质重建中发挥重要作用；破骨细胞是一种多核巨细胞,主要功能是骨质吸收,生理条件下与成骨细胞一起维持骨代谢的平衡：而破骨细胞的过度激活和功能异常被认为是炎性关节病人骨质侵蚀的重要诱因：已有报道在RA的CIA小鼠模型中观察到破骨细胞前体细胞(Osteoclast precursors, OCPs)的数量增多。破骨细胞起源于骨髓,其前体细胞在转录因子-KB受体激活因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony-stimulating Factor, M-CSF)的共同作用下,进一步分化为成熟的破骨细胞；RANKL和M-CSF是破骨细胞生成过程所必须的两个细胞因子,任何一个缺失或信号途径的阻断都会影响破骨细胞的分化。因此,破骨细胞的生成已成为关节炎关节破坏及治疗的重要靶点。已有报道证实,激活的nTregs可以抑制破骨细胞的生成,而iTregs具有与nTregs相似的表型和抑制功能。因此,本论文第二部分研究是在第一部分研究的基础上,探讨iTregs是否可以通过抑制破骨细胞的生成而发挥其对CIA模型动物的骨质侵蚀及破坏的抑制能力。实验结果：第一部分：TGF-p诱导的CD4CD25+Foxp3+调节性T细胞制备、鉴定及对胶原诱导性关节炎的抑制、治疗作用1. TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的制备、鉴定自DBA1/J小鼠的脾脏分离出幼稚的CD4+细胞。以牛CⅡ型胶原(bovine collagenⅡ, CⅡ)多肽、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)和TGF-β诱导Tregs (iTregs),单用IL-2培养的细胞为效应性T淋巴细胞,作为Tregs的对照(Tcon)。nTregs分离自同种小鼠的胸腺,在培养液中加入IL-2进行体外扩增,流式细胞仪、Western Blotting和PCR法分别检测Foxp3的表达；同时nTregs和iTregs分别与效应性T淋巴细胞共培养(绿色荧光蛋白CFSE标记法和增生实验),比较两者对效应性T淋巴细胞增生的抑制能力,实验设立基线值(baseline)、nTregs组、Tcon组和iTregs组。1.1 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞Foxp3的表达流式细胞仪的结果显示,经过扩增的nTregs与诱导的iTregs, Foxp3的表达相近,多在60%以上,而Tcon Foxp3的表达仅为10%左右。计数培养孔内的CD25+Foxp3+细胞数,Tcon组的细胞数显著低于iTregs组。Western Blotting检测CD4+ CD25-细胞、nTregs、Tcon和iTregs Foxp3蛋白的表达水平,nTregs与iTregs Foxp3蛋白的表达相近并均显著高于CD4＋CD25－细胞和Tcon。PCR法检测Foxp3 mRNA的水平,nTregs与iTregs Foxp3 mRNA的水平相近并均显著高于CD4+ CD25-细胞和Tcon。1.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对效应性T淋巴细胞的抑制能力体外CFSE标记法与增生实验法均证实,与基线值、Tcon组相比,iTregs拥有与nTregs相似的对效应性T淋巴细胞增生的抑制功能,而Tcon则与基线值相近,无法抑制T淋巴细胞的增生。2 TGF-β诱导的CD4CD25+Foxp3+调节性T细胞对CIA的抑制和治疗作用采用牛Ⅱ型胶原(4mg/mL)和完全弗式佐剂(体积比1：1)乳化液50ul于小鼠尾根部皮下注射诱导关节炎小鼠模型,在免疫后的第0天、第14天和第28天分别自小鼠尾静脉输注3×106 nTregs或iTregs,小鼠随机分为4组：CIA模型组、nTregs注射组、Tcon组和iTregs组,发病后隔天观察小鼠关节炎的发病率及临床评分。检测血清抗CⅡ特异性抗体的水平以及关节组织学染色,进一步评估疾病的严重程度。2.1 TGF-P诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对CIA的预防作用在DBAl/J小鼠免疫后的第0天分别注射nTregs和iTregs,两者都可显著抑制关节炎的发生和发展；在免疫后的第14天分别注射nTregs和iTregs, iTregs仍可降低关节炎的发生,两者均可显著降低关节炎的临床评分；并且检测血清抗CII特异性抗体水平发现,两种Tregs均可显著抑制抗CII IgG2b的水平。2.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对CIA的治疗作用在DBAl/J小鼠免疫后的第28天(即关节炎发病后)分别注射nTregs和iTregs, iTregs而非nTregs可以显著抑制关节炎的发生和严重程度,以及血清抗CII IgG2a和IgG2b的水平；病变关节组织学染色显示,iTregs可以显著抑制关节炎性细胞的浸润及骨质破坏的发生；分离自关节炎小鼠体内的淋巴细胞体外增生实验显示,iTregs尚可抑制淋巴细胞的增生程度和促炎症因子的水平；而nTregs则完全丧失了对关节炎的保护作用。小结：以上实验结果表明,iTregs拥有与nTregs相似的表型和对T淋巴细胞增生的抑制能力；同时,对CIA具有与nTregs相似的预防作用；但在已发病的关节炎小鼠,iTregs而非nTregs具有明确的治疗作用且抑制了关节破坏的发生,nTregs则完全丧失了对关节炎的保护作用。第二部分：TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞预防和治疗CIA的机制研究基于第一部分的研究结果,iTregs较nTregs在已发病的关节炎小鼠具有稳定的治疗作用,并可抑制骨质破坏的发生,我们在本部分将进一步探究其作用机制。3 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在体内、外的稳定性按照1中的描述分别制备nTregs与iTregs,进行如下实验：3.1 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在体外的稳定性采用与1.2相同的CFSE标记法与增生实验鉴定两者对效应性T淋巴细胞的抑制作用,同时设立IL-6添加组(IL-6+)与非添加组(IL-6-),检测在促炎症因子IL-6存在的情况下,两种Tregs抑制力的变化。建立Th17细胞培养体系即IL-6+TGF-P诱导幼稚的CD4+细胞向Th17细胞转化,在培养液中同样分别加入nTregs、iTregs (Tregs:幼稚CD4+细胞=1：4),比较两组IL-17A生成的水平。结果显示,在IL-6作用下,nTregs而非iTregs显著地丧失了其对效应性T淋巴细胞的抑制作用,并且无法抑制Th17细胞的分化及IL-17A的生成；而iTregs则始终保持着良好的抑制能力。3.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在体内的稳定性来自GFP-Foxp3转基因小鼠的nTregs和iTregs分别注射入免疫缺陷(CD3-/-)的小鼠体内,分别在注射后4周和8周观察Foxp3水平的变化；绿色荧光蛋白CFSE标记来自正常DBA1/J小鼠的两种Tregs并注射到同种小鼠体内,分别在注射后的1周和3周,检测两种Tregs Foxp3水平的变化；另将标记了CFSE的两种Tregs分别注射入已发病的关节炎小鼠(炎性小鼠)体内,观察两种Tregs在炎性环境下的稳定性和转归。3.2.1 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在免疫缺陷和正常小鼠体内环境下的稳定性在注射后4周和8周,nTregs和iTregs同样可以维持Foxp3的表达,Foxp3表达占CD3+细胞的百分比为50%左右。在正常体内环境下,nTregs和iTregs同样可以维持Foxp3的表达在50%左右(Foxp3占CFSE+细胞的百分比)。3.2.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在关节炎小鼠炎性环境下的稳定性实验结果显示,相对于iTregs, nTregs在细胞注射后1周的关节炎小鼠的引流淋巴结内,更易于凋亡、Foxp3的表达丢失并向Th2和Th17细胞转化；相反,iTregs在相似的炎性环境下能够维持Foxp3的表达且不会向辅助性T淋巴细胞转化。在nTregs注射组的关节炎小鼠淋巴结细胞中,Th17细胞的数量是iTregs组的10倍,而CFSE+Foxp3+细胞的数量为iTregs组的八分之一,提示了iTregs能够在炎性环境下诱导出更多的Foxp3+的调节性T细胞的产生。4 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞通过抑制破骨细胞的生成发挥对CIA的保护作用nTregs可以抑制破骨细胞的生成,而破骨细胞的生成过多是造成关节炎骨质破坏的主要因素；由此,我们将探究iTregs是否也通过抑制破骨细胞的生成而发挥对关节炎的保护作用。分离自正常DBA1/J小鼠骨髓的CDllc+细胞即破骨细胞前前体细胞(Osteoclast Precursors, OCPs),以RANKL和M-CSF共同诱导破骨细胞的生成；同时在培养液中分别加入CD4+CD25-细胞、nTregs, Tcon和iTregs,抗酒石酸磷酸酶(Tartrate-risistant acid phosphatase,TRAP)染色,观察各种细胞对破骨细胞生成的影响。nTregs、iTregs分别在免疫后14天注射入关节炎小鼠体内,观察期(56天)后,病变关节行CT扫描,观察关节骨质侵蚀、破坏的发生与不同。4.1 TGF-p诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在体外对破骨细胞生成的抑制作用实验结果显示,与基线值(baseline)、CD4+CD25-细胞组和Tcon组相比,nTregs和iTregs均可显著抑制破骨细胞的生成；减少加入的iTregs比例,破骨细胞的生成有所增加,但与Tcon相比,破骨细胞的生成仍受到显著抑制。提示iTregs对破骨细胞生成的抑制为剂量相关性的。4.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在体内对骨质侵蚀和破坏的抑制作用CT扫描结果显示,CIA模型组小鼠的关节呈慢性多关节炎的表现,关节表面骨质侵蚀明显,关节腔融合,关节强直,骨量减少；而iTregs仅表现为一侧关节的轻度关节腔狭窄,无骨质侵蚀的发生,关节腔间隙和骨量与正常的小鼠关节无异。5 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制破骨细胞生成的机制研究实验设立OCPs阳性对照组,和iTregs组,在iTregs与OCPs共培养组中分别加入同型对照(cIgG)组、抗TGF-β单抗组和抗IL-10R抗体组,观察iTregs是否通过TGF-β和IL-10信号途径发挥对破骨细胞生成的抑制作用；同时设立双层细胞培养板实验,观察iTregs对破骨细胞的抑制是否为细胞接触所依赖的；另外设立OCPs组、Tcon组和iTregs组,收集细胞,提取总蛋白,Western Blotting检测各组NF-κB亚单位P65和P50的表达水平,明确iTregs是否通过NF-κB途径发挥其抑制作用。5.1 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对破骨细胞生成的抑制为细胞接触而非细胞因子接触所依赖的实验结果显示,在加入了抗TGF-β和IL-10R中和抗体后,并未影响iTregs对破骨细胞生成的影响；但双层细胞板实验显示,iTregs一旦与OCPs分离培养,即无法抑制其分化成破骨细胞,提示,iTregs的抑制作用为细胞接触所依赖的。5.2 TGF-β诱导的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞通过NF-κB信号途径发挥对破骨细胞生成的抑制实验结果显示,iTregs与OCPs共培养组,NF-κB亚单位P65和P50的表达水平显著低于Tcon组及OCPs阳性对照组。小结结合上述实验结果,iTregs在免疫缺陷和正常小鼠体内环境下,都具有很好的稳定性,与nTregs相似；但在已发病的关节炎小鼠的炎性体内环境下,nTregs易于凋亡并向Th17细胞转化,同时还丧失了其对T淋巴细胞的抑制力；与之相反的是,iTregs能稳定存在,并维持了其对T淋巴细胞的抑制功能。此外,iTregs对CIA小鼠关节的保护作用,一定程度上得益于其对破骨细胞生成的抑制作用,从而减少了破骨细胞引起的骨质侵蚀和破坏；iTregs对破骨细胞的抑制为细胞接触和NF-κB信号途径所依赖的,并且表现为iTregs剂量相关性的。综合以上研究,所得结论如下：1.在体外,iTregs具有与nTregs相似的Foxp3的表达和对效应性T淋巴细胞的抑制能力。2.对CIA小鼠,iTregs具有与nTregs (?)目似的预防发病和减轻关节炎严重程度的作用。3. iTregs而非nTregs能保持对已发病关节炎小鼠的保护作用。4. iTregs对已发病的关节炎小鼠的治疗作用的可能机制如下：1).在体外促炎症因子IL-6存在的情况下,iTregs仍可保持其抑制力,而nTregs则丧失了大部分的抑制力。2).在体外,iTregs而非nTregs可以抑制Th17细胞的分化。3).在免疫缺陷和正常体内环境下,nTregs和iTregs具有相似的稳定性。4).在炎性环境下,iTregs而非nTregs稳定存在,且能显著降低促炎症因子IL-17A的水平。5).iTregs通过抑制破骨细胞的生成实现对关节炎小鼠骨质破坏的抑制作用,该作用为细胞接触和NF-kB信号途径所依赖的,并且表现为iTregs剂量相关性。5.本研究为将iTregs用于类风湿性关节炎的细胞治疗提供了理论依据。