手足口病(Hand, foot, and mouth disease, HFMD)主要发病于5岁以下儿童,其主要症状为儿童的口腔黏膜、手和脚上出现水疱疹。大部分手足口病发病可自愈,少数发病可并发急性脑膜炎、脑炎和急性心肌炎甚至死亡,是近年来严重危害我国儿童健康的丙类法定报告传染病,目前尚无特效治疗药物。手足口病可由多种小RNA病毒科人肠道病毒属的病毒引起,包括柯萨奇病毒内的多种血清型(Coxsackievirus A16、A4、A5、A9、A10、B2、B5)、肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)以及部分埃可病毒(Echo virus)。其中,肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇病毒A16型(CA16)是手足口病的两大最主要的病原体,在多次爆发的手足口病流行中均占主导地位。EV71感染除手足口病外可致无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病并引起儿童的死亡。CA16感染症状较EV71感染轻,一般不引起神经系统疾病,但却可能与心肌炎、心包炎密切相关,并引起低龄儿童的死亡。RNA干扰(RNA interference, RNAi),是一种由双链RNA (dsRNAs)介导的转录后mRNA水平沉默序列上同源的基因表达的一种序列特异性基因沉默机制,它也是生物细胞内基因组抵御外在感染和内部转座的一种古老的防御机制,广泛存在于各种生物,包括动植物、真菌、昆虫和后生动物体内。这个过程可以简单描述如下,dsRNAs首先被细胞内的核糖核酸酶Ⅲ类似物Dicer切割成21-23nt的小干扰RNA (small interfering RNAs, siRNAs),切割产生的siRNAs与一种多种蛋白的复合体RISC (RNA-induced silencing complex)结合后识别并降解与其同源的mRNAs。在近十年的研究过程中,这一理论被极大地丰富并已经大量投入到了应用中。在2001年,Elbashir发现,于哺乳动物中直接导入21-23nt的siRNAs可诱发RNAi效应。往后的几年,RNA干扰已经很大程度上能够代替基因敲除成为研究基因功能的有力手段。近年来,RNAi被大量应用于哺乳动物细胞的抗病毒研究并取得了卓越的成效。在本研究中,我们首先分离得到了于我国境内流行的CA16病毒和EV71病毒若干,并对分离得到的病毒进行了全基因组的测序分析后将所得病毒的全基因组序列提交GenBank。针对CA16病毒,我们将测序所得shzh05-1株的cDNA序列及其推测的氨基酸序列与GenBank数据库中收录的其他CA16病毒序列进行同源性比对。在序列比较和同源性比对的基础上选择开放读码框保守区不同的靶位点进行siRNAs的设计,并将所设计的siRNAs构建入siRNAs表达载体GeneBuster中。通过双荧光素酶报告基因分析系统,我们筛选得到了能有效抑制CA16病毒靶基因表达的siRNAs 13对。随后通过细胞水平的攻毒保护实验,从不同时间、不同剂量、预给药后感染病毒、感染病毒后治疗性给药、混合给药等多个层次、多个方面进行研究,验证了这13对siRNAs对病毒基因组复制和表达的良好抑制作用和对细胞的良好保护作用。针对手足口病的另外一重要病原体EV71,我们使用本室保存的SHZH98株和测序所得Fuyang-0805株与往年中国大陆流行的同属C4亚型毒株的全基因组序列做同源性比对,选取开放读码框保守区不同的靶位点进行siRNAs的设计后并直接化学合成,筛选得到能有效抑制EV71病毒靶基因表达的siRNAs 3对。随后通过细胞水平的攻毒保护实验比较了这三对siRNAs对不同毒株(Fuyang-0805和SHZH-98)复制的抑制情况,结果表明所设计筛选得到的3对siRNAs对这两株分别与不同时间不同地点在中国大陆流行的EV71病毒基因组的复制和表达均有非常好的抑制作用。抑制手足口病两大重要病原体CA16和EV71复制的小干扰RNA的筛选和验证,为抗手足口病药物的研发提供了重要的理论基础。