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目的:鼻咽癌是中国尤其是广东、香港地区常见的恶性肿瘤,病理类型以非角化癌最为常见。由于其对电离辐射高度敏感的特性,加之特殊的解剖部位限制了手术切除范围,迄今为止放射治疗仍是鼻咽癌治疗的主要手段。然而,放疗抵抗的形成使部分患者无法从这种治疗方式中受益。FA(Fanconi Anemia,范科尼贫血)通路是DNA损伤修复的重要通路之一,作为FA家族的成员,FANCD2(Fanconi Anemia Complementation Group D2,范科尼贫血互补组D2)在FA通路完成DNA损伤修复这一生物学功能的过程中发挥核心作用。本课题组在前期研究中成功获得shRNA-FANCD2沉默效应稳定的鼻咽癌CNE-2细胞,通过细胞功能实验证实沉默FANCD2表达可通过抑制细胞增殖、促进凋亡、改变细胞周期分布提高鼻咽癌CNE-2细胞体外放疗敏感性。本研究拟在课题组前期实验基础上,进一步通过裸鼠移植瘤模型在体内研究shRNA沉默FANCD2表达对鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响,并初步探索FANCD2调控鼻咽癌放疗敏感性的机制,为靶向FANCD2的鼻咽癌放疗增敏治疗提供理论依据。方法:本研究分为两部分进行:第一部分通过裸鼠移植瘤模型研究shRNA沉默FANCD2表达对鼻咽癌CNE-2细胞体内放疗敏感性的影响,主要方法为:(1)以鼻咽癌CNE-2细胞为研究对象,建立裸鼠皮下移植瘤模型。实验裸鼠随机分为两组:A组为未放疗组,B组为放疗组。A、B两组裸鼠再分别分为以下三组:(1)实验组:接种稳定转染shRNA-FANCD2干扰序列的CNE-2细胞(CNE-2SH),A、B两组分别记为N-CNE-2SH、R-CNE-2SH;(2)阴性对照组:接种转染FANCD2无效干扰序列的CNE-2细胞(CNE-2NC),A、B两组分别记为N-CNE-2NC、R-CNE-2NC;(3)空白对照组:接种未经任何处理的野生型CNE-2细胞(CNE-2),A、B两组分别记为N-CNE-2、R-CNE-2。在A、B两组中比较沉默FANCD2表达对CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长情况及体内放疗敏感性的影响。(2)移植瘤行HE染色病理切片,显微镜下观察各组瘤体组织病理学特点。(3)采用TUNEL[Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)-Mediated dUTP Nick-End Labeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记]法原位检测瘤体中的凋亡细胞,比较各组移植瘤细胞凋亡情况。第二部分初步探索沉默FANCD2表达提高鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的机制,主要方法为:(1)以CNE-2及CNE-2SH细胞为研究对象,基于基因芯片筛选沉默FANCD2表达后呈现差异性表达的基因。(2)借助DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,注释、可视化和集成发现数据库)、NCBI(National Center of Biotechnology Information,美国国立生物技术信息中心)数据库进一步了解差异基因的功能,初步确定沉默FANCD2表达提高鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的可能下游基因。(3)RT-qPCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,实时荧光定量聚合酶链式反应)检测各组鼻咽癌CNE-2细胞及对应的裸鼠移植瘤组织中差异基因——NUPR1(Nuclear Protein 1,核蛋白1)、FLI1(Friend Leukemia Integration 1,弗氏白血病整合蛋白1)及FGF21(Fibroblast Growth Factor 21,成纤维细胞生长因子21)mRNA表达情况。(4)IHC(Immunohistochemistry,免疫组织化学)法检测各组移植瘤组织中NUPR1、FLI1及FGF21蛋白表达情况。实验结果主要采用SPSS 23.0统计软件进行分析,辅以GpraphPad Prism 8统计作图、Adobe Photoshop CC 2018图片排版;基因芯片中基因表达差异性及P值采用GeneSpring GX软件进行分析,辅以R语言统计作图;实验数据以x±s表示,三组样本间比较采用方差分析,两组样本间比较采用t检验。检验水准为α=0.05;当P<0.05时,差异具有统计学意义。结果:第一部分:(1)各组细胞接种于裸鼠后均形成瘤体,成瘤率为100%。采用自身前后对照法比较放疗组(B组)瘤体放疗前后体积变化情况,结果显示:放疗前,R-CNE-2SH组移植瘤体积(453.300±27.312mm~3)显著小于R-CNE-2组与R-CNE-2NC组移植瘤体积(737.746±23.027mm~3、710.358±33.234mm~3)(F=124.115,P=0.000),体积抑瘤率为38.600±1.839%;放疗后R-CNE-2SH组移植瘤体积(216.350±27.759mm~3)亦显著小于R-CNE-2组与R-CNE-2NC组移植瘤体积(619.681±37.900mm~3、577.652±27.484mm~3)(F=199.175,P=0.000),体积抑瘤率为65.200±2.302%;进一步比较放疗前后各组移植瘤体积变化,结果显示R-CNE-2SH组经放疗体积减小了236.950±3.602mm~3,显著大于R-CNE-2组与R-CNE-2NC组体积减小量(118.065±17.510mm~3、132.707±35.332mm~3)(F=32.164,P=0.000)。采用平行对照法比较未经放疗(A组)与经过放疗(B组)的各组瘤体重量测量情况,结果显示:A组(未放疗组)中,N-CNE-2SH组平均瘤体重量(0.893±0.199g)显著小于N-CNE-2组与N-CNE-2NC组平均瘤体重量(1.826±0.438g、1.708±0.606g)(F=5.180,P=0.032),重量抑瘤率为50.700±5.115%;B组(放疗组)中,R-CNE-2SH组平均瘤体重量(0.338±0.140g)亦显著小于R-CNE-2组与R-CNE-2NC组平均瘤体重量(1.200±0.561g、1.103±0.398g)(F=5.429,P=0.028),重量抑瘤率为70.650±9.576%;进一步比较R-CNE-2SH组与N-CNE-2SH组瘤体重量,结果显示R-CNE-2SH组平均瘤体重量显著小于N-CNE-2SH组(t=4.558,P=0.004)。(2)移植瘤组织HE染色结果显示,癌细胞分布呈巢状、条索状或排列紊乱呈片状,细胞异型性明显,无明显细胞角化及角化珠形成,符合鼻咽癌组织病理学特征。A组(未放疗组)中,N-CNE-2组与N-CNE-2NC组癌细胞排列紧凑,核大而深染,未见明显坏死区,而N-CNE-2SH组瘤体组织中可见灶状坏死区,坏死区域内可见细胞核固缩、碎裂;B组(放疗组)中,R-CNE-2与R-CNE-2NC组瘤体内可见局灶状或小片状坏死区,局部可见核固缩、核碎裂,而R-CNE-2SH组瘤体内可见大片液化坏死区,坏死区内细胞核固缩、碎裂,甚至溶解,呈现大片胞质红染区。(3)TUNEL凋亡检测结果显示,未经放疗时(A组),N-CNE-2SH组平均细胞凋亡数(46.800±20.327个)显著高于N-CNE-2组与N-CNE-2NC组平均细胞凋亡数(10.000±3.873个、7.200±2.490个)(F=16.864,P=0.000);经放疗后(B组),R-CNE-2SH组平均细胞凋亡数(110.000±16.912个)亦显著高于R-CNE-2组与R-CNE-2NC组平均细胞凋亡数(45.200±12.153个、56.000±8.860个)(F=35.297,P=0.000);进一步比较R-CNE-2SH组与N-CNE-2SH组瘤体内细胞凋亡情况,结果显示R-CNE-2SH组平均细胞凋亡数显著高于N-CNE-2SH组(t=-5.344,P=0.001)。第二部分:(1)通过基因芯片技术共筛选出313个基因在CNE-2细胞与CNE-2SH细胞中呈现差异性表达,其中上调基因193个,下调基因120个。(2)根据DAVID及NCBI数据库检索结果,初步确定差异基因NUPR1、FLI1及FGF21为sh RNA沉默FANCD2表达提高鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的候选下游基因。这三个基因在CNE-2SH细胞中的原始信号值(3933.004±509.674、117.751±9.070、143.325±18.535)均显著低于其在CNE-2细胞中的原始信号值(13907.892±3520.280、278.602±35.726、663.739±78.371),差异有统计学意义(t=4.857,P=0.037)、(t=7.558,P=0.002)、(t=11.193,P=0.005)。(3)RT-q PCR结果显示,未经放疗时(A组),NUPR1、FLI1、FGF21三个差异基因在N-CNE-2SH组鼻咽癌细胞中的相对表达量(0.148±0.005、0.434±0.017、0.236±0.016)显著低于其在N-CNE-2组中的相对表达量(1.000±0.000、1.000±0.000、1.000±0.000),差异有统计学意义(t=322.026,P=0.000)、(t=57.568,P=0.000)、(t=84.715,P=0.000)。经放疗后(B组),上述三个基因m RNA在R-CNE-2SH组鼻咽癌CNE-2细胞中的相对表达量(0.067±0.014、0.236±0.044、0.078±0.026)亦显著低于其在R-CNE-2组中的相对表达量(0.363±0.029、0.504±0.031、0.483±0.030),差异有统计学意义(t=15.983,P=0.000)、(t=8.637,P=0.001)、(t=17.790,P=0.000);且R-CNE-2SH组鼻咽癌细胞中三个基因m RNA相对表达量显著低于N-CNE-2SH组(t=9.645,P=0.001)、(t=7.251,P=0.002)、(t=8.977,P=0.001)。此外,在未经放疗与经放疗后的各组移植瘤组织中检测到上述3个基因m RNA相对表达量变化趋势与细胞中的变化趋势一致。(4)IHC结果显示:未经放疗时(A组),NUPR1、FLI1、FGF21三个基因在N-CNE-2SH组移植瘤组织中的MOD(Mean Optical Density,平均光密度)值(0.019±0.003、0.016±0.002、0.021±0.003)显著低于其在N-CNE-2组中的MOD值(0.038±0.002、0.021±0.001、0.029±0.003),差异有统计学意义(t=9.171,P=0.001)、(t=4.438,P=0.011)、(t=3.893,P=0.018);经放疗后(B组),NUPR1、FLI1、FGF21三个基因在R-CNE-2SH组移植瘤组织中的MOD值(0.012±0.002、0.006±0.002、0.009±0.002)亦显著低于其在R-CNE-2组中的MOD值(0.022±0.001、0.010±0.000、0.019±0.003),差异有统计学意义(t=8.552,P=0.001)、(t=3.536,P=0.024)、(t=4.733,P=0.009);且这三个基因在R-CNE-2SH组移植瘤组织中测得的MOD值显著低于其在N-CNE-2SH组中的MOD值(t=3.550,P=0.024)、(t=6.653,P=0.003)、(t=7.060,P=0.002)。结论:(1)沉默FANCD2表达能抑制鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤的生长,并促进瘤体内细胞凋亡;(2)与单纯沉默FANCD2表达及单纯放疗相比,沉默FANCD2表达联合放疗后抑制瘤体生长和促进细胞凋亡的作用更为显著,表明沉默FANCD2表达可增强鼻咽癌CNE-2细胞体内放疗敏感性。(3)在鼻咽癌CNE-2细胞中沉默FANCD2基因表达可引起NUPR1、FLI1及FGF21基因表达下调;(4)沉默FANCD2表达介导鼻咽癌CNE-2细胞放疗增敏的分子机制可能与FANCD2沉默后调控NUPR1、FLI1及FGF21三个基因表达下调有关。