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H5 亚型高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza,HPAI）是一种重要的人兽共患病,严重威胁人类健康。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）不仅是专职的抗原递呈细胞,也是调控宿主天然免疫应答的关键。非结构蛋白1（Non-structrual protein 1,NS1）,一种流感病毒非结构蛋白,能够通过调控宿主天然免疫应答影响病毒毒力,是重要的毒力因子。近年来,H5亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）NS1蛋白80-84位氨基酸在禽和哺乳动物出现了新的演化模式,但这些新模式如何调控宿主天然免疫应答,如何影响病毒对宿主致病性等尚不明确。本研究首先分析了 H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸近20年的演化规律;其次,基于近5年来H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸优势回补模式（NIASV、TIASV、TVASS）运用反向遗传技术构建重组病毒株,并在体内及体外比较了重组毒对哺乳动物致病性的差异;最后,评价了各重组病毒对小鼠DCs天然免疫应答的影响。本研究将为H5亚型AIV的流行预警及致病机理研究提供理论依据。1、H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸不同回补模式病毒的构建及生物学特性的评价本研究首先通过对全球流感数据库中H5亚型AIV序列进行比对分析。对2000-2019年H5亚型AIV 80-84位氨基酸位点进行统计分析。结果发现,自2015年以来,NS1蛋白80-84位氨基酸的回补模式逐渐占据主导。经过筛选发现,近五年在禽类、哺乳动物中占据主要流行趋势的回补模式为NIASV、TIASV、TVASS。因此,以H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸天然缺失株BYG株（A/Goose/Baoying/20160916）为母本毒,通过反向遗传学技术成功构建了 NS1蛋白80-84位氨基酸三种回补模式重组毒:NIASV、TIASV、TVASS。其次,测定了四株重组毒的生物学特性包括鸡胚半数感染量（50%Embryo infective dose,EID50）及组织培养半数感染量（50%Tissueculture infective dose,TCID50）以及四株重组病毒在A549细胞上的复制情况。最后,通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription polymerase,qRT-PCR）法测定了 四株重组病毒对A549细胞产生干扰素（Interferon,IFN）及IFN下游相关基因的影响。结果显示,四株重组病毒的EID50在108.5-108.33 EID50/mL之间,MDCK细胞中TCID50在106.66-107.5 TCID50/mL之间。体外复制试验表明,NS1蛋白80-84位TVASS模式毒株在哺乳动物细胞A549上表现出更强的体外复制能力且能够增强IFN-β的转录水平并抑制Mx1、ISG56的转录水平。2、H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸不同回补模式病毒对小鼠致病性的影响本研究将四株重组病毒以106EID50/50 μL滴鼻感染BALB/c小鼠,每只小鼠滴鼻50 μL,并设置PBS对照组。测定体重变化并记录存活情况,连续观察14 d,并分别于感染后3、5、7d取小鼠的鼻腔、气管、肺脏、脑、脾脏,制作病理切片并通过qRT-PCR法测定各脏器病毒载量及细胞因子表达水平。体内致病性试验结果表明,TVASS组小鼠出现60%的死亡率,其他毒株组小鼠并无死亡。TVASS组小鼠肺脏病变严重,出现大量炎性细胞浸润,气管出现上皮细胞的严重脱落,其他组肺脏与气管也均有一定病变。所有重组病毒组均于3、5、7d在小鼠的鼻腔、气管、肺、脑、脾脏检测到病毒的复制。与母本株BYG组相比,仅TVASS组病毒在鼻腔、气管、肺中的载量显著增加,TVASS组小鼠肺部细胞因子TNF-α、IL-6、IP-10、IFNβ表达显著增加,但IFN下游蛋白Mx1、ISG15、ISG56表达减少。因此,NS1蛋白80-84位氨基酸TVASS的回补模式的病毒株对小鼠的致病性最强,可能是通过肺部“细胞因子风暴”以及抑制IFN下游蛋白的表达增强AIV对小鼠的致病性。3、H5亚型AIV NS1蛋白80-84位氨基酸不同回补模式病毒对小鼠DCs天然免疫应答的影响首先体外成功诱导培养小鼠骨髓源DCs,使用病毒纯化技术纯化了 NIASV、TVASS、TIASV、BYG四株重组病毒。将病毒以0.1 MOI感染DCs,并通过流式细胞术测定病毒对DCs感染能力、成熟表型、早期活化标志、迁移标志、刺激下游淋巴细胞增殖能力的影响,并用ELISA试剂盒测定上清中细胞因子的含量。结果表明,NS1蛋白80-84位氨基酸TVASS的回补模式毒株,具有较强的感染DCs的能力,并且DCs成熟表型标志（MHCⅡ、CD40、CD80）、早期活化标志（CD69）、迁移标志（CCR7）的表达显著增加,跨小室迁移试验结果也表明NS1蛋白80-84位氨基酸TVASS的回补模式毒株显著上调DCs迁移能力,同时诱导DCs 大量分泌细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p70、IL-10。DCs 与 CD4+T淋巴细胞的混合淋巴反应试验结果显示,NS1蛋白80-84位氨基酸TVASS的回补模式毒株感染DCs后显著刺激下游CD4+T细胞增殖。以上结果表明,NS1蛋白80-84位氨基酸TVASS的回补模式毒株通过激活DCs天然免疫应答,并通过级联放大方式诱导其它免疫细胞免疫应答激活,这可能是“细胞因子风暴”发生进而增强病毒对小鼠的致病性的潜在机制。