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目的:巨噬细胞浸润是糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)的重要组织病理特征,其在局部微环境中的活化状态是决定疾病转归和预后的主要因素。前期研究结果表明DN患者肾组织中浸润的巨噬细胞以M1型活化为主,M2型所占比例明显下降。自噬是一种由溶酶体介导的对细胞内过多或异常的蛋白质及细胞器进行降解的过程,是一个高度动态的、多阶段的过程,也称为自噬流,主要包括自噬体和自噬溶酶体两个阶段。近来研究发现,自噬在许多细胞功能的调节中发挥着重要作用,然而其在巨噬细胞M1/M2表型转换中是否存在作用及具体机制尚需进一步探讨。本研究拟通过体外培养巨噬细胞,探讨自噬对高糖环境下巨噬细胞活化状态的影响,并进一步探索自噬流各阶段对巨噬细胞表型转化的影响,为利用自噬调控巨噬细胞活化状态来防治疾病的发生和发展提供可能。方法:(1)用30.0 mmol/L葡萄糖孵育小鼠巨噬细胞RAW264.7,用自噬激活剂(RAPA)及抑制剂(3-MA)干预,通过Western blot、免疫荧光检测M1型标志物iNOS、TNF-α和M2型标志物MR、Arg-1,及自噬标志物LC3、Beclin-1、p62的表达。(2)用100U/mL IFN-γ+5 ng/mL LPS刺激RAW264.7细胞,诱导M1型活化;10 ng/mL IL-4刺激,诱导M2型活化。利用RAPA、3-MA、Bafi、CQ干预M1/M2经典模型中的自噬流各阶段,用上述方法检测M1、M2型及自噬标志物的水平,并进一步用电子显微镜观察自噬流情况。结果:(1)(1)高糖促进RAW264.7细胞表达iNOS、TNF-α,抑制MR、Arg-1的表达,诱导M1型活化;(2)高糖环境抑制RAW264.7细胞表达LC3、Beclin-1,促进p62的表达,降低了其自噬水平;(3)用RAPA干预提高自噬水平,会使高糖诱导的RAW264.7细胞iNOS表达水平下降,而MR表达增加,提示自噬水平升高时巨噬细胞趋向于M2型活化;用3-MA降低自噬水平后,其iNOS表达水平进一步上升,MR表达则下降明显,即降低自噬水平时巨噬细胞趋向于M1型活化。(2)(1)构建RAW264.7细胞的M1/M2模型,M1型抑制LC3、Beclin-1表达,促进p62表达,M2型自噬水平高于M1型;(2)电镜下观察到巨噬细胞中,自噬体形成、自噬体与溶酶体融合、自噬溶酶体形成、底物降解等自噬流过程;(3)M1型巨噬细胞中,RAPA促进自噬体生成,其LC3、Beclin-1、p62表达均增加;3-MA抑制自噬体生成,LC3、Beclin-1、p62表达水平均下降;Bafi抑制自噬体与溶酶体融合,其LC3、Beclin-1表达减少,而p62表达明显增加;CQ抑制自噬溶酶体降解,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62表达均呈升高趋势;(4)RAW264.7细胞的M1/M2模型中均可观察到,干预自噬流各阶段均可影响M1/M2型相互转化,即激活自噬可诱导细胞向M2型转化,而抑制自噬则诱导M1型活化。结论:1.高糖诱导巨噬细胞M1型活化,与其自噬降低有关;2.自噬流各阶段均能调节巨噬细胞M1/M2表型相互转化;3.单一标志物的变化不能判定细胞的自噬活性变化,需要评估自噬流的动态变化。