目的 在骨组织工程中对大量生物降解和可吸收材料，已经进行了广泛研究。细胞外支架是提供细胞粘附、增生和分化的基础，也是将生长因子固定于细胞组分上并维持三维空间结构，允许新的组织生成的支撑物。虽然，一些人对脱细胞的细胞骨架进行了描述，但迄今为止还没有见到较理想的脱细胞骨细胞外基质的制备及骨细胞外基质骨陷窝计量检测的详细报道。本实验进行脱细胞骨基质制备，去除细胞成分，并进行形态学观察，为骨组织工程的新型天然支架材料提供依据。小鼠骨髓基质干细胞在体外具有容易培养扩增的特点，在特定的诱导条件下可向多方向分化。因此它具有很广泛的应用价值，但在骨组织工程方面的应用并不多。我们以骨髓基质干细胞为种子细胞，在体外与脱细胞骨基质进行联合培养并观察，为组织工程的新型支架材料提供组织学实验依据。 材料与方法 1．材料 昆明小白鼠(中国医科大学实验动物中心)。Triton-X100，胰酶，DMEM培养基(CIBCO公司)，胎牛血清(天津TBD公司)。 2．AECM的制备 用戊巴比妥钠将鼠进行腹腔麻醉，取双侧股骨。修整成片状，剔除骨膜，PBS彻底清洗。向广口瓶中加入0.05M Tris-HCL(pH7.4)缓冲液，缓冲液内加入蛋白酶抑制剂(0.1μg/ml aprotinin，0.5μg/ml leupeptin，0.6μg/ml pepstatinA)，放入骨片。然后把瓶内液体换成内含3％TritonX-100的Tris-HCL(pH7.4)缓冲液，同样也加入上述蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡后，用蒸馏水连续冲洗。之后加人DNAse和RNAse混合液室温下消化12 ／J’时。再次向瓶中加人内含 3％TritonX－100的 TiS－HCLhH7．4）缓冲液，4℃下恒温震荡。蒸馏水充分冲洗后，将制备的脱细胞的骨片放人内含TiS－HCLhH7．4）液中，4t下保存备用。脱细胞的骨片用 Von Ebnel氏脱钙液脱钙30天。 3骨髓基质干细胞的分离，培养及鉴定。 无菌条件下，取 1月龄小鼠骨髓，加人 PBS中 1000转／分 10分钟离心，用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行吹打，置于37℃3％CO卜饱和湿度条件下培养，隔日更换培养液，待原代骨髓干细胞增殖贴壁成单层后，收集细胞。取部分细胞进行碱性磷酸酶染色，黄素红染色和Mallory染色。 4．细胞一支架联合培养 无菌条件下，收集基质细胞于 DMEM培养基中制成SX10‘／d浓度的细胞悬液，置于消毒备用的AECM中，利用抽吸作用力使细胞充分渗人 AECM孔隙中，在 37t，5％CO卜饱和湿度条件下联合培养，8小时后再次加人培养液，其后隔日换液。 5．组织学检查 相差显微镜下观察细胞于AECM上生长情况，联合培养7天，将复合物取出，部分以10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，IIE染色，光镜观察，部分样本以2．5％戊H醛固定，作扫描电镜观察。 结 果 1．AECM的特性 电镜下AECM可见骨陷窝，陷窝内细胞结构已经消失，经物理处理的AECM可见不规则的孔隙一网架结构，孔隙直径为100－400op，孔壁欠光滑，空隙率约为70％。 2．骨髓基质干细胞形态及生长分化 刚接种时，MSC汕one manDw stromal cell）在培养瓶底散在分 ·2·布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，核呈卵圆性，与周围的血细胞相混杂。二一2天后，MSC开始贴壁，贴壁细胞的形态逐渐变成三角形，梭形和不规则形。接种三周后，可见明显的集落形成。集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展。约2周长成单层。碱性磷酸酶染色为成骨细胞的特征性染色，MSCS细胞呈弱阳性。荤素红染色为钙的特异性染色，MSCS细胞呈弱阳性。而Mallory染色为胶原的特异性染色，MSCS细胞也呈弱阳性。 3．光镜观察 复合培养7天组织学切片显示，在AECM的孔隙中，有成团的蓝染的骨髓基质于细胞核团，核团的分布不均匀，周边的部分大于中间的部分。 4．扫描电镜观察 复合培养7天，扫描电镜下可见骨髓基质干细胞紧密贴附于AECM上，细胞成团排列，这与光镜的观察结果是一致的。 结 论 1．AECM细胞成分基本消失，保留了骨组织的细胞外基质成分。具有天然的骨组织基质形态。 2．骨髓基质于细胞具有能分化为成骨细胞的特性，可作为组织工程的种子细胞。 3．骨髓基质干细胞可在AECM中良好生长，AECM是一种新型的生物衍生材料，具有广阔的应用前景。