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背景:人胰腺癌是临床常见肿瘤之一,发病率呈上升趋势,手术可切除率在10%左右,以手术为主的综合治疗手段效果不好,术后转移早,其中位生存时间不足6个月,五年生存率小于5%;而在90%不可切除的病例中,化疗和放疗副反应大。因此,提高治疗效果,探索胰腺癌的基因治疗有重要意义。然而基因治疗的疗效并不令人满意,原因是多方面的,其中转移基因在靶细胞组织或器官中表达的时空特异性、基因治疗载体的安全性等问题严重影响了此项工作的进展。目的:以自杀基因大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因ePNP为调控的靶点,以人胰腺淀粉酶基因-2A(Amy-2)为胰腺组织特异性启动子和端粒酶亚单位hTERT为肿瘤靶向性启动子,构建载体phTPNPamyCre,使胰腺组织特异性启动子pAmy-2及肿瘤靶向性启动子phTERT先后顺序发挥调控,使ePNP在胰腺癌细胞特异性表达,而对其他组织和胰腺正常组织不发挥作用。方法:运用荧光素酶报告载体分别构建端粒酶亚单位hTERT为肿瘤靶向性启动子phTERT和胰腺组织特异性启动子pAmy-2质粒并检测其活性,利用分子生物学技术,结合PBS302和PBS185载体构建载体phTPNPamyCre;运用基因转染方法将phTPNPamyCre转染人胰腺癌细胞株Capan-1、SW1990、Panc-1、BxPC-3和MIAPaCa-2,建立BxPC-3·PNP的稳定细胞系,通过PCR、Westernblot、MTT实验等方法观察phTPNPamyCre/MePdR自杀基因系统对人胰腺癌细胞靶向治疗作用。结果:1.构建成功phTERT-luc和pAmy2-luc载体,证明了hTERT和Amy-2的启动子在相应细胞内的转录活性;利用原核表达系统表达了ePNP蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,制备得到鼠抗ePNP蛋白的多克隆抗体;2.在肿瘤细胞中,hTERT启动子能较好的驱动ePNP基因表达及在胰腺细胞中Amy-2启动子能较好的驱动Cre重组酶蛋白的表达;3.构建成功的双启动子调控ePNP的载体phTPNPamyCre有很好的胰腺组织特异性和肿瘤靶向性,在胰腺肿瘤细胞中能很好的表达ePNP蛋白;4.phTPNPamyCre转染胰腺癌细胞后,对MePdR有较好的敏感性,且呈剂量依赖性,并有一定的“旁观者”效应。结论:phTPNPamyCre/MePdR自杀基因治疗系统对人胰腺癌细胞有很好的靶向治疗作用