前言视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)是一种具有代表性的退行性视网膜变性疾病。RP患者最终都会因视网膜感光细胞死亡而致视功能下降甚至完全丧失。RP已成为发达国家主要的致盲性眼病。视网膜色素变性的遗传学机制复杂。目前所知的就有超过50个基因的异常与RP的发病有关,这还未包括在每个基因内所可能发生的大量突变(比如,仅rhodopsin就有近100种突变)。这样高度的异质性使对这类疾病中感光细胞死亡机制的研究困难重重。通过对众多RP患者及RP动物模型的研究分析,目前普遍认同:在视网膜变性的进程中,感光细胞死亡最终都是通过一条共同通路——凋亡。凋亡进程的异常启动是感光细胞死亡的重要机制。凋亡是多基因严格控制的过程,因此也成为干预视网膜变性疾病切实可行的着手点。能够模拟人类疾病的理想动物模型为研究疾病的发生、发展机制所不可或缺。由于诱发视网膜感光细胞凋亡的病因多种多样(如遗传、物理射线、和化学药物等),病理机制也错综复杂,特定的动物模型往往仅能在某种特定的方面模拟人类疾病的特征,故而也仅能就某种特定机制的洞悉和干预为人类的研究提供参考。既往的研究证实:N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea.MNU)诱导的大鼠视网膜变性是由于感光细胞凋亡所致。由于MNU诱导的感光细胞损害具有高度的可重复性,这种动物模型成为研究人类视网膜变性治疗措施的有用工具。MNU属于亚硝基化合物中的亚硝酰胺类,是广泛分布于环境中的强烷化剂。关于MNU对大鼠视网膜的毒理学研究表明:在经MNU腹腔注射后的大鼠感光细胞核上可见甲基化的DNA嵌合物形成(7—甲基脱氧尿苷DNA嵌合物);MNU对感光细胞DNA的烷化作用是其引起视网膜毒性的直接原因。烷化剂对细胞DNA的损伤如果没有被修复,则细胞将发生凋亡。那么在MNU损害感光细胞DNA之后,哪些细胞凋亡机制参与了感光细胞的凋亡启动呢?在该进程中,哪些节点是可以干预甚至被阻断的呢?米诺环素是第二代半合成四环素类药物的衍生物。具有分子量小、亲脂性高,可通过血—脑屏障、易吸收等特点。临床观察证实,患者长期服用米诺环素安全而有效。近年来的多项研究发现,米诺环素对神经系统变性疾病具有安全有效的保护作用(亨廷顿病,肌萎缩性侧索硬化症,帕金森病,脑和脊髓损伤等)。在眼科学领域的研究也证实,米诺环素具有同样的神经元保护作用。目前的研究结果提示,米诺环素的神经保护作用与其抗菌作用无关,而可能是通过两条不同的途径:第一种机制涉及米诺环素的抗炎症作用,包括抑制小胶质细胞的活化、迁移(中枢神经系统中驻留的吞噬细胞在神经元病变时的活化,及其后的损害作用提示小胶质细胞介导了与神经元死亡相关的事件);第二种机制可能是由于其直接的抗凋亡作用,这种作用的靶点可能是在凋亡的Caspase级联反应途径中、或者其上游的细胞死亡程序。关于米诺环素的神经保护机制仍有待进一步的研究阐明。本课题通过腹腔注射MNU建立RP的大鼠模型,使用凋亡相关的基因芯片筛选该大鼠模型感光细胞损害进程中表达明显上调的凋亡相关基因并加以验证,以探讨MNU诱导感光细胞损害的作用机制,并在此基础上进一步观察米诺环素的凋亡拮抗作用,从而为研究视网膜感光细胞凋亡的干预方法提供实验基础。第一部分MNU诱导大鼠视网膜感光细胞凋亡作用的观察目的建立由腹腔注射N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea.MNU)所诱导的视网膜感光细胞凋亡的大鼠模型,并观测其视网膜病变的特征。方法SD大鼠腹腔注射MNU(60 mg/kg)后12、24、48、72小时、5日及7日处死,摘取眼球,采用组织病理学观察、透射电镜扫描、免疫组织化学染色、以及流式细胞仪检测的方法来观测和验证该动物模型视网膜感光细胞的病变特征。结果腹腔注射MNU后仅见大鼠视网膜的外核层感光细胞发生凋亡。在造模后的早期,视网膜其他层次的细胞没有发生凋亡或明显形态改变。感光细胞的凋亡在腹腔注射MNU(60 mg/kg)后12小时即已开始发生。在MNU注射后12、24、48、72小时和7日,模型大鼠后部(视神经乳头两侧各400-800μm距离内)视网膜ONL的凋亡指数分别为:(16.3±2.1)%、(31.5±3.4)%、(19.3±1.5)%、(17.2±1.2)%、以及(3.8±1.5)%。流式细胞仪检测正常对照大鼠以及MNU注射后12、24、48、72小时的模型大鼠视网膜凋亡细胞比例分别为:(6.88±0.81)%、(7.98±1.45)%、(12.2±4.44)%、(9.63±2.78)%、以及(10.15±1.56)%。由于所计数细胞的基数不同,因此凋亡指数和流式细胞仪检测的凋亡细胞比例不相同,但两种方法检测的凋亡高峰都出现在MNU注射后24小时。造模后72小时,模型大鼠后部视网膜外核层明显变薄;造模7日后大鼠视网膜的感光细胞基本消失。结论通过腹腔注射MNU能够特异性诱导SD大鼠视网膜外核层的感光细胞发生凋亡,从而建立模拟人类视网膜色素变性的大鼠模型。该模型稳定,可重复性好,因而适用于感光细胞凋亡机制的研究、以及感光细胞凋亡拮抗药物的筛选实验。第二部分MNU诱导大鼠视网膜感光细胞凋亡机制的探讨第一节MNU上调大鼠视网膜感光细胞凋亡相关基因的筛选目的筛选MNU模型大鼠早期视网膜中表达上调的凋亡相关基因。方法SD大鼠腹腔注射MNU(60 mg/kg)后12小时,随机选择4只大鼠处死后立即摘取双眼视网膜。8只眼视网膜混合用作RNA提取、cRNA合成及纯化,与凋亡相关的寡核苷酸芯片(ORN-012,Superarray)进行杂交,对MNU注射后12小时的大鼠视网膜凋亡相关基因进行筛选,实验重复3次。使用SAM(Significant Analysis of Microarray,Stanford University)3.02软件进行基因差异表达数据的分析。判断基因差异表达的筛选标准:与正常组的比值＞2.0(上调2倍)。建立“模型组—对照组,凋亡相关基因差异表达谱”。采用GenMAPP 2.1软件(Gene Microarray Pathway Profile)对基因差异表达数据进行生物途径分析。结果在MNU注射后12小时的模型大鼠视网膜内有6个凋亡相关基因的表达显著上调:TNFR1(3.3倍)、FADD(7.7倍)、CASPASE 8(9.0倍)、CASPASE3(2.4倍)、BAK 1(6.5倍)、以及BAX(2.8倍)。按基因功能分类,TNFR1属于TNF受体家族,FADD属于死亡效应域家族,CASPASE 8和CASPASE 3属于CASPASE家族,BAK 1和BAX属于BCL-2家族成员。基因差异表达数据的生物途径分析结果提示,细胞膜受体和线粒体途径介导的凋亡机制可能参与了MNU诱导的感光细胞凋亡。结论TNFR1、FADD、CASPASE 8、CASPASE 3、BAK 1、以及BAX的表达上调可能参与了MNU损伤感光细胞DNA后所导致的早期凋亡级联反应。第二节MNU上调大鼠视网膜感光细胞凋亡相关基因的验证目的对基因芯片的筛选结果选择性地进行验证。方法SD大鼠腹腔注射MNU(60 mg/kg)后12小时,在模型组和对照组中随机各取5只大鼠的眼球,眼球固定液固定,作石蜡切片;在模型组和对照组中随机各取6只大鼠的视网膜标本,置于液氮中冻存,将每只大鼠的双眼视网膜组织混合用于一次RNA或蛋白抽提。由于TNFR1和FADD可能是CASPASES上游的凋亡启动信号,因此采用免疫组织化学染色、real time PCR、以及Westernblot方法对TNF RI、FADD在mRNA和蛋白质水平的表达进行验证。结果MNU模型大鼠腹腔注射MNU后12小时其视网膜感光细胞特异性的表达TNF RI和FADD。两者在mRNA和蛋白质水平都发生上调。结论MNU导致视网膜感光细胞TNF RI和FADD表达上调。对基因差异表达数据进行生物途径分析提示TNF R1/FADD/CASPASE的凋亡信号传导通路可能参与了MNU损伤感光细胞DNA后所导致的凋亡级联反应。第三部分米诺环素拮抗MNU诱导大鼠视网膜感光细胞凋亡作用的研究目的观察米诺环素拮抗MNU所诱导的视网膜感光细胞损害的作用,并探讨其作用机制。方法实验大鼠被随机分入正常对照组(不加干预)、MNU模型组(一次性60 mg/kg MNU腹腔注射)、米诺环素对照组(腹腔注射米诺环素)、米诺环素干预组(腹腔注射米诺环素、MNU)。米诺环素干预组中的大鼠分别在接受MNU腹腔注射前的12小时、以及MNU注射后每12小时经腹腔注射米诺环素(50mg/kg)。米诺环素对照组中的大鼠在与米诺环素干预组中大鼠相同的时点腹腔注射米诺环素(50 mg/kg)。采用组织病理学方法、免疫组织化学方法、流式细胞技术、real time PCR以及Western蛋白免疫印迹法对米诺环素的作用及其机制进行观察评价。结果米诺环素干预组大鼠在72小时的ONL损害较模型组减轻,视网膜凋亡细胞比例下降。与MNU模型组相比,米诺环素干预组大鼠视网膜的TNF R1、FADD在mRNA和蛋白质水平的表达下调,差异有统计学意义。结论米诺环素能够延缓MNU所导致的大鼠视网膜感光细胞凋亡进程,该作用与抑制感光细胞的TNF RI、FADD的表达上调有关。