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现有的抗病毒药物比如核苷类似物(nucleotide analogues,NAs)、聚乙二醇化的干扰素α(PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα)等可以有效抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制,但是难以清除肝细胞内的HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。残余的cccDNA容易导致停药后慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的复发甚至进展。因此肝内cccDNA的水平是判断乙肝是否被治愈的重要参考指标。然而直接肝脏穿刺活检检测肝内cccDNA的水平属于有创检查,无法作为常规临床检查手段,需要寻找无创的替代手段,比如血清学检查反映肝内cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多种不同长度的转录本,其中3.5kb的前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)是唯一能够反转录生成松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rc DNA)负链的转录本。rc DNA是完整HBV颗粒的必要组成,因此pgRNA是HBV复制周期中的关键分子。血清中的pgRNA水平被证明和肝脏内cccDNA的转录活性具有较好的相关性,尤其在经过NAs治疗的病人,血清pgRNA比血清HBV DNA更能反映肝内cccDNA的转录活性,并且能够帮助判断停用抗病毒药物后乙肝在病毒学水平复发的几率,对于指导停药时机具有重要意义。因此血清pgRNA有望成为新的临床检验指标。尽管血清HBV RNA有独特的临床意义,但是其仍然无法替代HBV DNA成为更好的临床检测指标:HBV DNA水平不仅是决定患者是否进行抗病毒治疗的重要依据,同时也是评价患者病毒学应答的重要指标。另外有研究显示,HBV RNA与DNA的比值在不同自然感染史的CHB患者之间存在显著差异,因此HBV DNA和RNA的综合水平对于判断HBV感染阶段、疾病预后具有重要意义。但是目前临床上只有标准化的HBV DNA检测试剂盒,而无HBV RNA的标准检测方法。如果将来HBV RNA成为新的临床检验指标,也往往需要同时检测HBV DNA和RNA,如果分别检测必定带来耗费更多人力、时间、试剂、耗材和检测样品等问题。另一方面,目前检测HBV RNA尚无公认的常规方法,既往文献中的检测手段均存在一定局限。例如本课题的研究证明了直接抽提RNA并用oligo d T或基因特异性引物(gene specific primer,GSP)反转录的定量PCR可能因为难以消除的HBV DNA污染而存在定量不准,并且即使用DNase消化RNA提取物中的DNA也无法完全排除HBV DNA的干扰。还有其它文献报道了利用Quantigene核酸定量、微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCRds)等新技术进行HBV RNA的检测,虽然具有高灵敏度、特异性等优点,但是由于需要先进且昂贵的配套设备,目前只适用于实验室研究,尚难以在临床得到普及和推广。本课题开发了一种新的利用双重荧光定量PCR同时检测核酸提取物中pgRNA和DNA的方法,在克服了以往检测HBV RNA方法容易受到HBV DNA污染局限的同时,实现了两项指标的双检,相较于分别检测HBV DNA和RNA,可节省一半以上时间,以及减少一半的样本量需求,并且我们证明了该检测体系具有较高的特异性、准确性。本课题共设计有两种检测策略,第一种是反转录后拷贝数相减法的定量策略,适用于检测细胞培养上清标本,理论上也适合用于血清的检测;第二种策略是针对第一种的改良,方法是特异性扩增带锚定序列的c DNA然后定量,该改良检测策略对于检测细胞培养上清和细胞标本都能够胜任。综上,本课题设计的检测方法可以同时定量检测核酸提取物中HBV DNA和HBV RNA且具有定量准确、特异性好等优点,另外操作简单,节约了时间和人力物力成本,需要的检测样本量较少,因此能够较好地满足临床检验需求,具有潜在的转化价值。