论文部分内容阅读
海水鱼类的养殖已经成为我国海水养殖的支柱产业。但由于缺乏良种,养殖鱼类的生长缓慢,肉质下降,病害频发等已严重影响养殖业本身的发展。培育快速生长、抗病抗逆等优良品种,对于水产养殖业的可持续发展具有重要意义。
染色体操作是鱼类遗传育种的重要方法之一,在过去20多年中,被广泛地应用于人工养殖种类的遗传改良研究中,有些已经实现了产业化,是较活跃且具有较好发展前景的育种技术。其研究内容主要包括多倍体的人工诱导(Polyploidy induction)、雌核发育(Gynogenesis)和雄核发育(Androgenesis)等技术。本研究以我国北方养殖的牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象,以静水压力和温度刺激两种方法抑制牙鲆受精卵的第一次卵裂,诱导了牙鲆四倍体和有丝分裂雌核发育二倍体,获得了最佳诱导条件,培育了大量的四倍体和雌核发育二倍体个体,并对牙鲆四倍体和雌核发育二倍体进行了初步养殖试验和生长比较。结果如下:
1、采用静水压力抑制普通二倍体受精卵的第一次卵裂,诱导染色体加倍,培育四倍体。结果表明,受精后40-100min内、用45-70MPa的压力处理1-10min时,多数处理组均能获得不同比例的正常孵化仔鱼,但压力处理的不同起始时间、压强的高低以及压力处理的不同持续时间对正常仔鱼孵化率有较大的影响。实验获得的四倍体最佳诱导条件是:从受精后70min开始,在55 Mpa.压强下持续处理6min,这一条件下四倍体的诱导率达到15.6%。采用染色体观察和最大核仁数测定方法对获得的正常仔鱼的倍性进行检测,结果发现,正常仔鱼中四倍体的比例与孵化率有较好的吻合关系,可以用孵化率的高低作为四倍体诱导率的指标,最佳条件下培育的四倍体群体中,四倍体比例达到63.3%。
采用最佳条件大批量处理受精卵,获得四倍体群体的幼鱼7000余尾,对六月龄的幼鱼进行红血球直径测量,用流式细胞仪测定幼鱼血细胞相对DNA含量,结果表明,群体中四倍体约占13%,其红血球直径为14.67±1-06lμm,二倍体占87%,其红血球直径为12.41±0.575um。这些四倍体个体的生长和形态正常,与二倍体对照无明显差异,但四倍体生长速度比二倍体慢,而且有较大的个体差异,六月龄时二倍体平均全长17.32±0.985 cm,而四倍体平均全长为15.29±1.204 cm。
2、用冷休克法抑制二倍体受精卵的第一次卵裂,诱导牙鲆四倍体。结果表明,如果处理前受精卵保持在15.5±0.5℃,受精后65-90min内,用0-6℃的温度处理15-90min,均可以诱导四倍体产生,较高温度处理、处理起始时间过完或处理持续时间较短时,仔鱼孵化率较高,但孵化仔鱼中四倍体比例较低,8℃以上的处理温度对诱导四倍体无效。冷休克诱导牙鲆四倍体的最佳条件是:从受精后75min开始,在2℃下持续处理45min,这一条件下四倍体的诱导率达到12.7%。
3、采用静水压力抑制第一次卵裂使染色体加倍,诱导了有丝分裂雌核发育二倍体。首先探索了紫外线辐射使牙鲆精子遗传失活的条件,将无Ca<++>和无Mg<++>的Ringer氏液稀释的精液置于紫外灯源下10cm处,光源为2只平行的、相距15cm的20W紫外灯管。在10-120s照射范围内,照射效果表现了典型的哈特维希效应,在照射55s时胚胎的孵化率达到最高峰,几乎所有仔鱼都表现出单倍体综合症。染色体观察结果显示,在10-40s照射组中,部分胚胎的细胞中有2个核仁,但这部分胚胎是非整倍体,50s以上照射组胚胎全都有24条染色体,为单倍体,表明照射的有效性和可靠性。压力条件实验结果表明,受精后不同压力起始时间、不同的静水压力以及静水压力处理的不同持续时间,对于抑制牙鲆第一次卵裂有较大差异,最佳处理条件为:在受精后75min开始,用55MPa的压力,持续处理6min,此条件下二倍体诱导率最高,达12.3%。
采用最佳条件大批量处理受精卵,获得雌核发育二倍体幼鱼10000余尾,生长对比实验表明,雌核发育二倍体生长速度比二倍体对照慢,而且表现出较大的个体差异,六月龄时二倍体对照的平均全长17.32±0.985 cm,而雌核发育二倍体平均全长仅为10.44±1.169 cm,两者差异高度显著。
从60日龄起到150日龄止,用饵料重量比10ppm的甲基睾丸酮投喂雌核发育二倍体进行人工性转换,性转换群体的生长速度变慢,6月龄时平均全长为9.73±1.367cm,比普通二倍体明显小(P<0.01)。性比分析显示,雌核发育群体中雌性占86.7%,雄性个体占13.3%;而性转换群体雌性占20%,雄性个体占80%。说明10ppm的甲基睾丸酮诱导可使雄性诱导率达到较高的比例。
四倍体、有丝分裂雌核发育二倍体以及性转换群体的培育成功,为牙鲆全雌三倍体品种的培育、克隆鱼的培育等奠定了基础。