【摘 要】
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乳腺癌的转移和复发是现阶段肿瘤治疗的主要问题之一,大量研究表明传统的化疗仅杀死大部分已经分化的肿瘤细胞,使肿瘤体积一段时间减少甚至消失,而少部分具有干细胞特性的肿瘤细胞处于休眠期（cancer stem cells,CSCs）难以被杀灭。少量富集的CSC具有极强的致瘤性,其能增殖分化成新的肿瘤组织。因此,针对肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞的联合化疗有可能彻底治愈癌症。本课题以对乳腺癌干细胞具有特异性杀伤
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乳腺癌的转移和复发是现阶段肿瘤治疗的主要问题之一,大量研究表明传统的化疗仅杀死大部分已经分化的肿瘤细胞,使肿瘤体积一段时间减少甚至消失,而少部分具有干细胞特性的肿瘤细胞处于休眠期（cancer stem cells,CSCs）难以被杀灭。少量富集的CSC具有极强的致瘤性,其能增殖分化成新的肿瘤组织。因此,针对肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞的联合化疗有可能彻底治愈癌症。本课题以对乳腺癌干细胞具有特异性杀伤的药物盐霉素（SAL）和化疗药物紫杉醇（PTX）作为模型药物,设计抗肿瘤联合纳米系统。本课题研究内容分四大部分,第一步将盐霉素以胱胺二盐酸盐为连接臂与D-a-生育酚琥珀酸脂（TOS）合成盐霉素前药（TOS-ss-SAL,TS）,第二步以生物相容性好的高分子透明质酸（HA）为骨架材料,设计具有CD44靶向的两亲性的聚合物（HA-TOS,HT）以及具有CD44和Biotin受体的双靶向两亲性接枝聚合物（Biotin-HA-TOS,BHT）用于表面修饰盐霉素前药自组装纳米粒制备。通过核磁共振氢谱和红外光谱结果鉴定HT、BHT、TS前药的成功合成。第二部分,盐霉素前药纳米粒（TS NPs、HTS NPs、BHTS NPs）的构建及其理化性质考察,盐霉素前药纳米粒在10 m M DTT条件下发生降解证实其还原敏感性;通过盐霉素前药纳米粒和血清孵育实验验证其血浆中的稳定性,可满足静脉注射的要求。细胞生物学方面通过干细胞成球抑制率和周期实验验证盐霉素前药纳米载体具有干细胞周期阻滞和成球抑制的作用,证实盐霉素前药纳米粒具有抗肿瘤干细胞作用,其疏水核心可作为传统化疗药物的纳米递送载体。以香豆素6（Cou）制备成荧光标记的纳米粒,通过流式细胞实验验证纳米粒的靶头可以增加细胞摄取作用,结果表明靶向修饰的HTS NPs和BHTS NPs的细胞摄取水平明显高于无修饰的TS NPs,且通过竞争饱和实验验证了CD44和Biotin受体介导的细胞摄取机制,荧光倒置显微镜成像的观察结果和流式细胞结果相一致。第三部分,通过乳化溶剂挥发法制备了载PTX的盐霉素前药纳米粒（PTXTS NPs、PTX-HTS NPs、PTX-BHTS NPs）,通过X-射线衍射实验证实PTX和TS前药较好分散在纳米粒中,以无定型状态存在于纳米粒中;通过膜过滤法-高效液相色谱法测定三个纳米粒制剂的PTX的包封率在87.24%-92.61%,载药量在2.99%-3.08%;通过马尔文粒径仪测定纳米粒的粒径在190.7nm-280.2nm;电位在-6 mv到-29 mv左右;PDI为0.16-0.27。通过透射电镜TEM观察到大小均一的圆形纳米粒;通过体外释放实验验证纳米粒在还原型谷胱甘肽（GSH）的作用下加快了PTX的释放,说明前药纳米粒具有肿瘤微环境敏感的释药特征。第四部分,共载PTX的前药纳米粒的细胞毒实验表明TS NPs自身能够有效抑制肿瘤细胞增殖,前药纳米粒和PTX具有协同的抗肿瘤效应,相比TS NPs和游离PTX,PTX-TS NPs具有明显提高的增殖抑制效果,其中具有双靶向修饰的PTX-BHTS纳米制剂表现出最为显著的增殖抑制效果;3D肿瘤球的球生长抑制实验结果与细胞毒实验结果相一致,相比游离PTX和空白的TS,载PTX-TS NPs具有明显的肿瘤球生长抑制效果,其中双靶向的PTX-BHTS纳米制剂表现为显著的肿瘤球穿透效应,完全抑制肿瘤球生长且破坏肿瘤球结构。综上所述,基于前药的双修饰的纳米粒具有高效和精准的输送药物至乳腺癌细胞和干细胞的潜能,从而达到更好的抗肿瘤效果。
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