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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起怀孕母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状，自1987年首次报道以来，已形成全球性流行并造成了很大的经济损失。该病的病原为PRRSV，随着毒株的毒力变异，新的强毒株不断出现，并能引起免疫过的猪场发病，而且人工致弱的疫苗毒也能返强而引起临床疾病。目前尚无理想的针对PRRS的预防和控制措施，因此加强对该病的监测尤为重要。本文分别用真核和原核表达系统对PRRSV核衣壳蛋白基因进行了高效可溶性表达，并用重组的核衣壳蛋白作为抗原，成功地建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。另外，还对PRRSV的凋亡诱导作用进行了研究。 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在杆状病毒表达系统中的表达 用RT-PCR扩增出美洲型PRRSV VR 2332株核衣壳蛋白(N)基因，首先克隆到pGEM-T easy载体，再亚克隆到转座载体pFastBacl，最后将含有PRRSV核衣壳蛋白基因的表达盒转座到穿梭载体Bacmid中。重组质粒转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒reBac-N，经扩增后重组杆状病毒的滴度达到5×10~8pfu／ml，以5个MOI的reBac-N感染Sf9细胞，经SDS-PAGE和Western blot证实N蛋白已获得表达，分子量约15kDa，与天然核衣壳蛋白大小一致。分别于感染后24、48、60、72、96、120小时收获表达产物，可见重组N蛋白于感染后72小时表达量最高。经免疫荧光染色和SDS-PAGE证实，PRRSV N蛋白非分泌性、可溶性地表达于Sf9细胞胞浆内。取感染reBac-N的Sf9细胞裂解上清进行间接ELISA，可见重组核衣壳蛋白具有良好的抗原性，能与PRRSV猪抗血清发生特异性反应。另外，以重组核衣壳蛋白为免疫原制备的多抗鼠血清能与大肠杆菌中表达的GST-N融合蛋白发生特异性反应，表明Sf9细胞内表达的重组核衣壳蛋白也具有良好的免疫原性。 二、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其表达产物的纯化制备 国内外许多学者分别利用不同的表达载体对PRRSV核衣壳蛋白基因进行了原扬州大学博士学位论文核表达，其中部分报道还对核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达方式进行了分析，结果均是以包涵体形式存在。本试验将美洲型PRRSV vR 2332株核衣壳蛋白基因克隆到表达载体pGEX一6P一1中谷眺甘肤一S一转移酶(GST)基因的下游，重组质粒转化大肠杆菌BL21，通过对各种表达条件进行优化，实现了PRRSV核衣壳蛋白基因在原核表达系统中的可溶性表达。经SDS一PAGE和Western blot分析，GST一N融合蛋白的分子量约为39.skDa，另外，还有三种不同大小的GST一N降解产物，分子量分别为33 kDa，30.5 kDa和27.5 kDa，39.5 kDa的GST一N及其30.5 kDa的降解产物分别占菌体蛋白的30.9%和巧.3%，总表达量约占菌体蛋白的一半。重组菌经超声波裂解后，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化表达产物，每毫升床体积的GST一N融合蛋白收获量达1 smg，回收的GST一N融合蛋白浓度达到smg/ml。用Prescission Protease切去GST一N融合蛋白中的GST成分，得到纯化的重组核衣壳蛋白。经间接ELISA证实，大肠杆菌中表达的GST一N融合蛋白以及切去GST纯化的N蛋白均可作为诊断抗原，用于PRRSV抗体的检测。用GST一N融合蛋白以及切去GST后纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠制备的抗血清均能与Sfg细胞内表达的重组核衣壳蛋白发生特异性反应，可见PRRSV核衣壳蛋白的原核表达产物也具有良好的免疫原性。三、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用 分别用昆虫细胞内表达的重组核衣壳蛋白(Bac一N)、大肠杆菌内表达的GST一N融合蛋白、以及切去GST后纯化的N蛋白作为诊断抗原，同时设立必要的阴性抗原对照，结果可见Bac一N、GST一N以及N蛋白均能特异性地识别PRRSV抗体阳性血清样品和阴性血清样品，而且根据针对阴性抗原以及阴性抗体反应的0D值可见，三种检测用抗原都具有较高的敏感性。因此，Bac一N、GST一N、N蛋白均可作为诊断抗原，用于PRRSV抗体检测。但考虑到Bac一为昆虫细胞裂解后的粗提制剂，含有较多的细胞蛋白成分，需设立正常Sfg细胞裂解上清作为阴性抗原对照，同一份血清样品要对阳性抗原和阴性抗原同时进行平行检测，而上述N蛋白纯化抗原的制备需要蛋白酶PreSCISSion阶otease的切割，从而大大增加了抗原制备的经费开支，因此选用亲和层析纯化的GST一N作为检测抗原。 以方阵滴定法确定GST一N最佳包被浓度为每孔400ng，待检血清最佳稀释度为1:10。。血清样品的0D490〕0.43 x ODPo:+0.57 x0D二判为阳性，反之判为阴性。用建立的间接ELISA分别检测猪瘟阳性血清、猪细小病毒病阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪口蹄疫阳性血清、猪大肠杆菌病阳性血清、猪气喘病阳性血清，结陈义平:猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的高效可溶性表达和检测血清抗体的间接ELISA方法的建立m果均为阴性，说明该方法具有高度的特异性。取8份不同OD值的血清样品进行6次批内重复试验，结果其变异系数一般不超过5%;36份血清样品分别用两个不同批次包被冻存的酶标板进行检测，结果也完全相同，说明建立的间