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生育酚（tocopherol）俗称维生素E,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化物质,为人体所必需。在天然存在的4种生育酚中,α-生育酚的生物活性最高且被人体优先吸收和利用。植物油是人类膳食中α-生育酚的主要来源,但在大多数植物油中,α-生育酚含量很低而其生物合成前体γ-生育酚含量较高。例如,大豆油中α-生育酚的含量仅占生育酚总量的7%,而γ-生育酚却高达70%,这一现象与α-生育酚合成途径中γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）的活性有关。本课题组合作单位中国科学院微生物研究所从结球甘蓝（Brassica oleracea var.captitata）中克隆了γ-生育酚甲基转移酶编码基因的全长cDNA序列（命名为BoTMT）,体外原核表达实验表明,BoTMT表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚。本课题组为培育高α-生育酚水平的转基因大豆,将BoTMT结构基因克隆到质粒pBin438中,构建了植物组成型表达载体pBin-TMTL和种子特异性表达载体p7S-TMTL。 本研究在上述工作基础上,利用植物组成型表达载体pBin-TMTL和种子特异性表达载体p7S-TMTL,以大豆子叶节为外植体,用农杆菌介导法转化大豆,以期获得α-生育酚含量高的转基因大豆。实验期间共获得再生植株330株,其中转p7S-TMTL的203株,转pBin-TMTL的127株。在以上再生植株中,PCR检测呈阳性的有58株,其中转pBin-TMTL的31株,转p7S-TMTL的27株。通过Western blot检测发现4株呈阳性反应,初步说明BoTMT已整合到大豆的基因组中并有效表达。在T1代中,有10株PCR检测呈阳性,初步证明外源基因已遗传给后代。上述研究结果为进一步获得高产α-生育酚的转基因大豆奠定了基础。 此外,本文还优化了农杆菌介导子叶节转化体系,发现在种子灭菌时,氯气熏蒸灭菌法优于升汞灭菌法:比较了吉林小粒1号、H6001、NF58等3个品种的再生效率,发现吉林小粒1号的再生能力最强、其次为H6001,NF58最弱;在共培养基中添加Na2S2O3、半胱氨酸和DTT附加光培养处理,可以减轻子叶节的褐化。