论文部分内容阅读
现代社会对化石能源的过度依赖,致使气候变化和能源危机成为人类社会正面临的两大危机。开发可再生、环境友好的新型能源,尤其是生物能源,已成为当今世界研究热点。微藻能够通过光合作用高效固定CO2并将太阳能转化为化学能,其中能源微藻能将光合作用产物直接转化为油脂积累在细胞中,具有生长速度快、油脂含量高等优点,因而利用能源微藻实现CO2减排和生物燃料的生产具有巨大的应用前景。系统研究能源微藻响应CO2驱动下的全局性代谢调控机制,阐明光合作用与储能物质转化的相关代谢通路,发现关键代谢调控点并作为后续基因改造的靶点,对于进一步提高能源微藻光合固碳效率、提高生物量和油脂产率具有重要理论意义。本研究以具有高光合固碳能力的普通小球藻（Chlorella vulgaris CS-42）和耐低温富油的亚椭圆胶球藻（Coccomyxa subellipsoidea C-169）为研究对象,利用细胞组学技术系统研究了它们响应CO2补充的生理生化调控规律、固碳和产油性能;利用代谢组学技术对前者的代谢谱和代谢通路、转录组学技术对后者的转录谱进行了全局性分析,阐明了各自的代谢网络调节机制。主要研究结果如下:1、CO2驱动下普通小球藻CS-42的细胞组和代谢组学研究（1）在光生物反应器中,系统评价了5%CO2补充下普通小球藻CS-42的生理生化变化趋势,进而揭示了细胞内合成代谢的代谢流变化规律。结果表明,在5%CO2补充下,普通小球藻CS-42的比生长速率、生物量产率和CO2固定速率都显著提高,胞内碳水化合物及脂肪酸含量显著上升（p<0.05）;。基于流式细胞术和激光共聚焦显微术的细胞组学分析表明,培养后期中性脂快速积累并导致胞内形成大量油滴,并伴随着培养液中氮源的快速消耗。GC-MS分析表明,5%CO2补充更有利于C18:2的合成,并因此导致总脂肪酸不饱和度的下降。这就说明5%CO2补充能高效刺激小球藻生长,并通过提高培养基C/N促进碳代谢流流向碳水化合物和脂肪酸的合成。（2）利用GC/TOF-MS联用技术,系统分析了普通小球藻CS-42对照组（通空气,CO2含量0.04%,v/v）和处理组（5%CO2,v/v）在培养192、240、288、312h时的全细胞代谢物谱,结合多元变量统计分析,发现代谢物谱差异性并鉴定出代谢标志物,并利用通路分析阐明细胞全局的代谢调节机制。首先利用主成分分析（PCA）模型解释了培养后期各时间点代谢物谱的整体差异;再利用正交投影偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型揭示了288和312h代谢物谱的具体差异并分别鉴定出13种和26种代谢标志物,它们的丰度变化表明了胞内碳水化合物及脂肪酸合成途径的上调,氨基酸合成下调;代谢通路分析表明,糖酵解和TCA循环受到抑制,导致葡萄糖、果糖等的大量积累,而氨基酸合成因缺乏前体化合物而受到抑制;另外,TCA循环的减弱使acetyl-CoA积累并一定程度上促进了油脂合成。2、CO2驱动下亚椭圆胶球藻C-169的细胞组学和转录组学研究（1）系统研究了亚椭圆胶球藻C-169响应CO2补充时的代谢生理规律,综合评价了光合固碳和产油性能。结果表明,通入2%CO2优于5%CO2和空气,能显著提高生物量产率(222 mg L-1 d-1)、脂肪酸含量（48.5%干重）和产率(108mg L-1 d-1)以及光合固碳速率(0.431mg L-1 d-1)。说明亚椭圆胶球藻C-169在光合固碳及生产生物燃料方面具有一定的应用潜力。（2）利用新一代高通量测序技术对0.04%和2%CO2下培养4天的C-169细胞进行转录组学分析。结果表明,测序库可匹配基因9409个,占编码蛋白基因总数的96%;转录组测序数据经qRT-PCR验证可靠,原始数据已上传至NCBI的GEO数据库中;发现了响应CO2补充的差异表达基因（DEGs）1737个,其中871个基因显著上调,866个基因显著下调;通过Gene Ontology consortium和KEGG对DEGs进行注释。GO显著性富集分析表明,上调的DEGs富集于ATP偶联的质子传递、三羧酸循环、氮化合物代谢过程等生物过程中,而下调的DEGs主要富集于光合作用、光捕获等过程;通路富集分析表明,一系列中心代谢通路被显著调控,包括糖酵解及糖异生、光合作用中的捕光蛋白、三羧酸循环、丙酮酸代谢、氧化磷酸化、氮代谢和CO2固定等;（3）基于数据库KEGG对胶球藻C-169中心代谢通路的精细分析表明,受2%CO2补充驱动下,细胞内多条固碳途径得到增强,其中包括卡尔文循环、PEP和丙酮酸羧化反应和氨甲酰磷酸合成反应等,将更多的外部碳源整合到胞内碳代谢流中;前期活跃的光合作用所产生的大量还原力通过上调的铁氧化还原蛋白（Ferredoxin）和铁氧化还原蛋白-NADP+还原酶（FNR）传递至多种受体以供细胞快速生长和油脂积累所需;大部分参与糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化等过程的基因显著上调,这些过程的共同加强意味着细胞产生更多的ATP和代谢中间物,为细胞快速生长和合成代谢提供能量和物质基础;氮同化、CPS II酶的催化反应、GS/GOGAT循环和鸟氨酸途径被加强,这有助于细胞适应高C/N环境;脂肪酸降解基因下调,加上脂肪酸合成基因的持续上调,共同导致细胞后期油脂的大量积累。