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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌的90%,是一种高度恶性肿瘤,全球肿瘤相关死因第二位。由于HCC的病因尚未完全明确,并且缺乏特效的药物与治疗手段,HCC患者复发率高,预后较差。因此,关于HCC的新治疗方法迫切需要。肿瘤微环境是指肿瘤发生发展过程中所处的局部生物环境,主要包括免疫细胞、新生血管细胞、肿瘤相关成纤维细胞以及一些细胞外基质等。巨噬细胞为单核细胞谱系的单核吞噬白细胞,根据功能不同分为两型,即M1和M2型巨噬细胞。肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAM),以M2型为主。研究表明,TAM与肿瘤进展相关。肝脏内分布大量的自主神经,包括交感神经和副交感神经。交感神经系统激活并释放去甲肾上腺素和肾上腺素,能够激活肿瘤细胞或宿主基质细胞的β肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,β-AR),促进多种实体肿瘤的生长和转移。β2-AR是β-AR的亚型,属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR),具有七个跨膜螺旋的共同特征。有文献研究表明,β2-AR在肝癌中过表达,激活β2-AR可促进肝癌进展。同时,β2-AR也在巨噬细胞表面分布,激活小鼠体内β2-AR可调控巨噬细胞表型,使其向M2型分化。然而,肝癌M2巨噬细胞中β2-AR的激活对肝癌的影响及其相关机制尚不清楚。G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)属于GRK家族,是体内一类重要的激酶,分布广泛。GRK2的主要作用是使激动剂结合的GPCR磷酸化和脱敏。本实验室前期研究表明,抑制GRK2的表达可明显促进肝癌细胞系HepG2生长。GRK2是否通过调控M2巨噬细胞中的β2-AR参与HCC进程,目前不清楚。本研究首先收集肝癌患者及肝内胆管结石患者石蜡标本,以及肝癌患者新鲜肝组织标本,通过研究肝癌患者石蜡切片中CD163和CD206的共表达及肝癌患者新鲜肝组织标本中CD163和CD206的表达,探讨M2巨噬细胞与HCC的相关性;通过研究肝癌患者石蜡切片中β2-AR和CD163及GRK2和CD163的共定位,探讨M2巨噬细胞中β2-AR和GRK2的表达与HCC的关系。其次,体外特异性激动M2巨噬细胞的β2-AR,将肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721和M2巨噬细胞上清共培养,检测肝癌细胞功能变化;进一步使用GRK2 siRNA转染M2巨噬细胞,检测干扰M2巨噬细胞GRK2表达对肝癌细胞的影响,以及M2巨噬细胞β2-AR下游信号通路的变化,分析GRK2调控M2巨噬细胞的β2-AR影响HCC的机制。目的:收集临床HCC患者肝癌石蜡切片及新鲜肝癌组织,观察M2巨噬细胞在肝癌中的表达,以及β2-AR、GRK2分别与M2巨噬细胞的共定位情况,并与患者临床特征进行分析。体外诱导M2巨噬细胞,特异性激动β2-AR,与两种肝癌细胞共培养,并进一步下调M2巨噬细胞GRK2的表达,明确M2巨噬细胞中GRK2调控β2-AR信号在肝癌中的作用及相关机制。方法:整体实验,收集行肝癌切除术的80例HCC患者,10例肝内胆管结石(对照)的组织石蜡标本,以及20例肝癌患者新鲜肝组织标本和其中6例相应的癌旁组织(对照),统计患者临床资料。根据美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)2010年制定的TNM(Tumor Node Metastasis)分期标准,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期,其中Ⅰ+Ⅱ期患者共34人,Ⅲ+Ⅳ期患者共46人。通过免疫荧光双染法标记CD163、CD206(M2巨噬细胞标记物),通过Western blot法检测人肝癌新鲜组织中CD163和CD206的表达;通过免疫荧光双染法分别标记β2-AR和CD163以及GRK2和CD163,Image-Pro Plus计算β2-AR和GRK2分别与CD163的共表达情况,比较对照组、Ⅰ+Ⅱ期肝癌及Ⅲ+Ⅳ期肝癌共表达的变化。体外实验,选取人THP-1细胞系,诱导M2巨噬细胞,用免疫荧光双染法标记CD163、CD206进行鉴定。选用人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721,收集经选择性β2-AR激动剂特布他林(terbutaline,Terb)刺激的M2巨噬细胞分泌的上清液,与肝癌细胞共培养。MTT、划痕和Transwell实验分别检测肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力;转染GRK2 siRNA后,收集经Terb刺激的M2巨噬细胞上清,与肝癌细胞共培养,再次用MTT、划痕和Transwell实验检测肝癌细胞功能变化。分别收集GRK2 siRNA染前后,经Terb刺激的M2巨噬细胞分泌的上清液,抗体蛋白芯片法检测各组中细胞因子的变化;Western blot和流式法检测GRK2 siRNA转染前后,Terb刺激不同时间点M2巨噬细胞膜上β2-AR表达的变化;ELISA试剂盒检测GRK2 siRNA转染前后,Terb刺激不同时间点M2巨噬细胞中cAMP表达的变化;Wsetern blot法检测GRK2 siRNA转染前后,M2巨噬细胞β2-AR下游信号通路分子PKA、CREB、p-CREB、STAT3、p-STAT3表达变化。结果:1.M2巨噬细胞在肝癌组织中的表达免疫荧光双染结果表明,Ⅰ+Ⅱ期肝癌患者肝组织切片CD163和CD206的共表达比对照组上升,在Ⅲ+Ⅳ期肝癌患者肝组织切片中进一步升高。同时,Western blot结果表明,Ⅰ+Ⅱ期肝癌患者新鲜肝组织中CD163和CD206的表达比对照组升高,在Ⅲ+Ⅳ期肝癌患者新鲜肝组织中进一步升高。2.β2-AR和CD163,GRK2和CD163的在肝癌组织切片中的共表达及与患者临床特征的关系免疫荧光双染结果表明,β2-AR和CD163的共表达在晚期肝癌患者中升高;而GRK2和CD163的共表达在晚期肝癌组中减少。SPSS 16.0软件分析共表达与患者临床特征关系的结果表明,β2-AR和CD163,GRK2和CD163的共表达均与性别、年龄、肿瘤包膜是否完整、是否有肝炎病毒感染无关。而β2-AR与CD163的共表达在肿块较大或有血管受侵的患者中升高,在有局部淋巴结转移的患者中未见明显变化;GRK2与CD163的共表达在肿块较大或有血管受侵、有局部淋巴结转移的患者中降低。3.M2巨噬细胞的诱导和鉴定人THP-1细胞经PMA(320 nmol/L,24 h)和IL-4(20 ng/mL,24 h)、IL-13(20ng/mL,24 h)诱导后,由圆形悬浮细胞变为类圆形或纺锤形贴壁细胞。免疫荧光双染结果表明,>90%的诱导后细胞均有CD163和CD206共表达。4.Terb对M2巨噬细胞吞噬功能的影响流式结果显示,M2巨噬细胞的吞噬功能比THP-1吞噬功能明显提升。经Terb刺激后,M2巨噬细胞吞噬功能下降,当Terb浓度达到10~-55 mol/L时,吞噬功能下降最为明显。故后续实验Terb浓度选为10~-55 mol/L。5.激动M2巨噬细胞的β2-AR促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,下调GRK2表达进一步促进了肝癌细胞功能Terb激动M2巨噬细胞的β2-AR后,通过MTT、划痕实验和Transwell实验,分别将M2巨噬细胞上清与肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721共培养。结果表明,激动M2巨噬细胞的β2-AR,促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭。进一步将GRK2siRNA转染M2巨噬细胞,发现下调M2巨噬细胞的GRK2表达,进一步促进了共培养的肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。6.下调β2-AR激动的M2巨噬细胞中GRK2,增加其培养上清中促肿瘤因子的分泌为了进一步探讨下调M2巨噬细胞GRK2表达,对M2巨噬细胞上清液中细胞因子分泌的影响,采用抗体芯片检测了其培养上清液中的细胞因子水平。结果显示,GRK2 siRNA+Terb组中IL-6、MMP-9、VEGF的表达较Terb组明显上升。7.下调β2-AR激动的M2巨噬细胞中GRK2表达延缓细胞膜上β2-AR的内化Western blot和流式结果显示,GRK2 siRNA+Terb组和Terb组细胞膜β2-AR的表达在Terb刺激10 min达峰值,但GRK2 siRNA组比Terb组的表达有明显提升。同时,GRK2 siRNA+Terb组中M2巨噬细胞胞膜β2-AR的表达在达峰后的下降比Terb组明显减慢,提示下调M2巨噬细胞中GRK2表达,延缓细胞膜上β2-AR的内化,使其在胞膜上作用时间延长。8.下调β2-AR激动的M2巨噬细胞中GRK2表达,促进β2-AR下游信号通路激活为了进一步明确M2巨噬细胞中β2-AR被激活后,下游信号通路的变化,采用ELISA试剂盒检测了cAMP的变化。结果显示,下调M2巨噬细胞中GRK2表达后,cAMP的表达在Terb刺激5 min时比Terb单独作用组明显升高,并在Terb作用10 min时达峰值,表达量约是Terb单独作用组峰值的2倍。在Terb作用15 min时,GRK2 siRNA+Terb组的表达量仍明显高于Terb组。同时,Western blot实验结果显示,GRK2 siRNA+Terb组中PKA、p-CREB和p-STAT3的表达明显高于Terb组。提示下调M2巨噬细胞中GRK2表达,激活了β2-AR/cAMP/PKA/CREB和β2-AR/cAMP/IL-6/STAT3信号通路,可能与肝癌进展相关。结论:1.CD163和CD206的共表达在HCC患者肝组织切片中增多,且Ⅲ+Ⅳ期患者比Ⅰ+Ⅱ期患者更明显,CD163和CD206的表达在HCC患者新鲜肝癌组织中增多,且Ⅲ+Ⅳ期患者比Ⅰ+Ⅱ期患者更明显。提示晚期HCC患者肝组织中M2巨噬细胞的数量增多。2.β2-AR和CD163的共表达在Ⅲ+Ⅳ期肝癌组织中上升,GRK2和CD163的共表达在Ⅲ+Ⅳ期肝癌组织中下降。β2-AR和CD163的共表达在肿块直径大或有TNM分期晚的患者中上升;GRK2和CD163的共表达在上述临床特征患者及有区域淋巴结转移患者中降低。提示M2巨噬细胞的β2-AR和GRK2异常表达可能参与HCC的进展。3.特异性激动M2巨噬细胞的β2-AR,与其上清共培养的肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭能力增强。下调β2-AR激动的M2巨噬细胞中GRK2的表达,进一步促进与其上清共培养的HepG2、SMMC-7721肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。提示GRK2可调控M2巨噬细胞的β2-AR促进肝癌细胞的生长和转移。4.下调β2-AR激动的M2巨噬细胞中GRK2的表达,激活β2-AR/cAMP/PKA/CREB和β2-AR/cAMP/IL-6/STAT3信号通路,使M2巨噬细胞分泌促肿瘤细胞因子增多,促进了肝癌细胞的恶性生物学行为。