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原生质体融合是克服有性生殖障碍和传统育种方法局限的一种有效补充手段,而高效的原生质体再生体系是原生质体融合研究的先决条件。本研究分离、培养木薯品种TMS60444(Manihot esculenta Crantz)脆性胚性愈伤组织(FEC)悬浮系原生质体,探索适合木薯原生质体培养及再生的条件。在此基础上,分离木薯品种华南8号(SC8)(Manihot esculenta Crantz)叶肉原生质体,对愈伤原生质体和叶肉原生质体进行电融合并培养,展开木薯原生质体融合再生研究。主要结果如下: 1.木薯愈伤原生质体培养再生研究。采用液体浅层法培养。培养密度为5×105时, TM2G培养基中葡萄糖浓度设6个梯度,依次为0.39 mol/l、0.36 mol/l、0.33 mol/l、0.30 mol/l、0.27 mol/l、0.24 mol/l。实验表明,葡萄糖浓度介于0.30-0.36 mol/l之间时,适合木薯愈伤原生质体培养。愈伤原生质体在TM2G葡萄糖浓度0.30 mol/l时,用5×105个/ml和2×105个/ml2个密度培养。在5×105个/ml的培养密度下,长出的都是致密型愈伤(能长成胚状体),而2×105个/ml的密度下培养长出的有致密型愈伤,也有空泡型愈伤(不能长成胚状体)。结果表明,密度5×105个/ml较适合培养木薯愈伤原生质体。胚性愈伤在MSN、CIM培养基,分别在光、暗条件下再生胚状体。结果显示,在MSN光下再生胚状体较好。本实验共挑出1479个致密愈伤,产生了757个子叶胚,已再生完整植株186棵。 2.木薯原生质体融合再生。电融合参数采用本实验室柑橘融合的常用参数:交变电场强度(AC)100 v/cm,交变电场作用时间60 s,直流脉冲强度(DC)1250 v/cm,直流脉冲作用时间45μs,直流脉冲间隔时间0.5 s,直流脉冲次数5次。实验表明此参数可用于木薯原生质体融合。融合产物培养时,兼顾叶肉原生质体,TM2G葡萄糖浓度0.36 mol/l时较适合。目前已从融合再生产物中挑出144个胚性愈伤,其中33个细胞系再生了子叶胚状体,13个细胞系已进入生芽伸长阶段。对其中61个细胞系经流式细胞仪鉴定,发现1个三倍体、11个四倍体、1个六倍体、2个非整倍体、4个嵌合体,其余为二倍体。 本研究对前人所指出的瓶颈问题有所改进,愈伤原生质体再生植株效率有较大提高。首次开展木薯原生质体融合研究,融合产物部分已再生子叶胚状体,正在生芽伸长过程中。