急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其是重症患者常见的并发症,可由多种原因引起,常表现为肾脏功能急剧下降、伴或不伴少尿或无尿,有较高的病死率。AKI发病率逐年升高,2013年一项横断面研究表明,根据KIDGO标准我国住院病人AKI检出率为1%（根据扩大标准,检出率为2%）^[1]。AKI已成为住院病人预测死亡率的独立危险因素^[2],单纯AKI患者死亡率为10%,AKI合并多器官功能障碍时死亡率可达50%,当AKI进展到需要肾脏替代治疗时死亡率高达80%^[3,4]。由于缺乏有效的治疗手段,AKI易进展至慢性肾脏病甚至终末期肾病,重症患者需要肾脏替代治疗,给家庭和社会带来了极大的经济负担。因此,需要深入探讨AKI损伤机制,为急性肾损伤提供新的治疗靶点。线粒体是氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所,是机体的能量工厂,除此之外,线粒体还承担了细胞分化、细胞信息传递和细胞死亡等生理功能^[5]。线粒体功能障碍在急性肾损伤发病机制中发挥重要作用^[6],而氧化应激是导致线粒体损伤的重要因素。活性氧（Reactive oxygen speices,ROS）过量产生并累积,攻击线粒体膜蛋白、脂质和线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）,导致线粒体功能障碍。线粒体功能障碍主要表现为:线粒体呼吸链氧化磷酸化（OXPHOS）功能障碍而导致ATP产生减少、线粒体ROS生成增加以及mtDNA受损（拷贝数降低和突变）^[7]。8-氧鸟嘌呤（8-oxo-Guanine,8-oxo-G）由鸟嘌呤在氧化应激下产生,是DNA损伤最常见的产物,其与腺嘌呤错配,从而发生GC-AT的点突变。人类MutY DNA糖基化酶（human mutY homolog,hMUTYH）是修复8-oxo-G的关键酶之一,通过剪切与8-oxo-G错配的腺嘌呤启动碱基切除修复途径（Basic excision repair,BER）而发挥其保护作用^[8]。据报道,MUTYH的突变与常染体显性遗传的家族性腺瘤息肉病有关（MUTYH-associated polyposis,MAP）^[9]。此外,MUTYH功能的缺失可致线粒功能障碍而引起神经元的退行性改变^[10]。MUTYH在肾脏疾病中的研究发现MUTYH基因AluYb8变异与中国人群慢性肾功能衰竭密切相关^[11];Lu等^[12]在单侧输尿梗阻模型及体外细胞纤维化模型中发现线粒体型MUTYH表达显著降低,提示MUTYH可能通过调控线粒体功能,参与慢性肾脏疾病的发生、发展。MUTYH在急性肾损伤中的作用及机制尚不明确,我们设想MUTYH能够通过修复急性肾损伤中的氧化应激所致的DNA突变损伤,维持线粒体DNA的稳定性而发挥保护作用。目的:应用MUTYH基因敲除小鼠肾脏缺血再灌注模型以及缺氧/复氧诱导的体外肾小管上皮细胞损伤模型,观察MUTYH的表达变化及其在急性肾损伤中的作用和机制。方法:（1）体外实验:体外培养小鼠近端肾小管上皮细胞（Renal epithelial tubular cells,RETC）,传代并铺板,缺氧12小时后复氧4小时收取细胞。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;Real-time PCR（实时定量PCR）检测MUTYH基因核酸水平表达;Western blotting检测Bcl-2、MUTYH总蛋白水平表达。（2）体内实验:野生型鼠建立肾脏缺血再灌注I/R模型,分为假手术组（Sham）及模型组（I/R）;MUTYH全身敲除小鼠建立I/R模型,以野生型小鼠作为对照,分为Sham组(MUTYH^（+/+）+Sham),MUTYH基因敲除小鼠组(MUTYH^（-/-）+Sham),模型组(MUTYH^（+/+）+I/R),MUTYH基因敲除小鼠模型组(MUTYH^（-/-）+I/R)。肾脏缺血再灌注24小时后处死小鼠,收取肾脏组织标本。心脏取血,3000rpm离心10min分离血清,检测肌酐及尿素氮水平。HE染色光镜下观察肾脏组织病理形态、肾脏炎症浸润及肾小管损伤程度;PAS染色观察肾脏组织病理形态改变及肾小管损伤程度,并使用改进后的Broekema盲法对各组小鼠肾脏病理损伤程度进行评分（肾脏皮质区损伤范围<25%为1分,25-50%为2分,50-75%为3分,>75%为4分）;应用Real-time PCR检测MUTYH、肾脏损伤因子1（kidney injury molecular,KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin,NGAL）、炎症因子TNF-α及MCP-1的核酸水平表达;应用Western blotting检测MUTYH、NGAL的蛋白水平表达;免疫组化检测肾脏组织中MUTYH、8-oxo-G的表达及分布;免疫荧光检测MUTYH在组织中的表达及定位。结果:（1）缺氧/复氧刺激体外培养的肾小管上皮细胞后,与对照组相比较,缺氧/复氧组的细胞凋亡增加3.0倍（P=0.0003）;细胞增殖能力明显下降（降低了60%,P<0.0001）;Bcl-2蛋白表达水平显著降低,仅为Sham组的50%（P=0.0016）;MUTYH核酸表达升高为Sham组的142%（P=0.0056）;MUTYH总蛋白表达下降了31%（P=0.0256）。（2）野生型小鼠的I/R模型中,HE染色显示小管组织结构破坏、炎症细胞浸润;肾组织PAS光镜下显示,肾小管上皮细胞变性、肿胀,肾小管坏死脱落,刷状缘丢失,小管内管型形成,模型组损伤分数为3.25±0.71,提示模型制备成功。模型组野生型小鼠血肌酐（176.70±54.86μmol/L）水平较Sham（7.45±3.34μmol/L）组升高22.71倍（P<0.0001）,此外血尿素氮（69.76±8.58mmol/L）也显著上调,为Sham组的（8.24±1.11 mmol/L）7.47倍（P<0.0001）。肾脏损伤因子KIM-1、NGAL核酸水平均显著升高,分别增加了251.88倍（P=0.0137）及1139.6倍（P=0.0011）,且NAGL蛋白水平也升高了2.55倍（P=0.0031）。炎症因子TNF-α及IL-1βmRNA表达显著增加,分别为Sham组的6.44倍（P=0.0163）和3.86倍（P=0.0268）;Western blotting结果显示单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）蛋白表达明显增加,灰度值定量分析结果显示模型组较Sham组增加了60.1%（P=0.0092）。此外,在模型组中,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白水平下降69.6%,其定量具有统计学差异（P=0.0277）。免疫组化检测8-oxo-G,与Sham组相比,模型组肾小管皮质中8-oxo-G阳性信号明显增多,IOD值是Sham组的2.56倍（P<0.0001）。应用qPCR和Western blotting对肾组织中的MUTYH表达进行定量分析,结果显示,模型组MUTYH核酸水平是Sham组的2.61倍（P=0.003）,但总蛋白水平显著下降,下降了40.5%（P=0.0351）;免疫荧光显示MUTYH主要表达于胞浆中,细胞核中也有较少的表达,总荧光强度下降约47.6%,且以胞浆型下降为主;应用免疫组化对MUTYH在肾脏中的表达进行定位,发现MUTYH主要定位于肾小管上皮细胞,模型组肾组织中MUTYH表达显著下降,是Sham组的45.5%（P=0.0008）。（3）MUTYH基因敲除小鼠I/R模型显示,MUTYH基因敲除后缺血再灌注诱导的肾组织病理损伤更为严重,光镜下可见大面积肾小管坏死、刷状缘脱落、炎症浸润以及管型形成,其病理损伤评分为（3.00±1.00）,与模型组（1.83±0.75）相比具有统计学差异（P=0.0392）。肌酐、尿素氮（139.70±27.15μmol/L,69.8±27.11 mmol/L）较野生型小鼠升高更为明显,分别为模型组（27.75±1.48μmol/L,24.70±16.16 mmol/L）的5.03倍及2.83倍。KIM-1、NAGL核酸水平显著上调,分别为模型组的3.94倍及3.24倍（P=0.0216,P=0.0364）。Western blotting结果显示NGAL增多更为显著,定量为模型组1.98倍（P=0.0582）。Real-time PCR检测炎症指标,MUTYH基因敲除小鼠MCP-1较模型组显著升高,为其2.38倍（P=0.0498）,TNF-α为模型组的1.6倍（P=0.027）。结论:小鼠肾小管细胞缺氧/复氧及野生型小鼠I/R模型中MUTYH总蛋白水平显著降低,提示该基因可能参与肾小管急性损伤的病理生理过程;MUTYH基因敲除加重缺血再灌注诱导的急性肾损伤,提示MUTYH在急性肾损伤中发挥保护作用。