神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1.NRP-1)是一种跨膜糖蛋白。NRP-1作为一种新型的细胞表面受体,通过介导VEGF通路来促进血管的生成。实验研究表明,NRP-1主要通过VEGFR-2途径上调VEGF表达量。在NRP-1敲除的转基因小鼠模型中发现血管的形成受到抑制。根据本实验室初级毛囊和次级毛囊转录组测序数据,发现在初级毛囊和次级毛囊中NPR-1表达差异为3.16倍。基于以上现象和理论,为了证实NRP-1在次级毛囊生长和发育中的功能,本研究探讨了建立过表达NRP-1转基因阿尔巴斯白绒山羊模型的技术路线,同时运用质谱分析、免疫共沉淀、Western Bolt、荧光定量PCR、哺乳动物双杂交系统等技术手段,进一步探究NRP-1在次级毛囊生长中相关信号通路以及其功能。1.NRP-1过表达转基因阿尔巴斯绒山羊模型的建立构建NRP-1过表达转基因载体,转染至阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞,通过核移植方法,生产过表达NRP-1转基因阿尔巴斯白绒山羊胚胎。结果成功构建了NRP-1过表达转基因载体,并且得到了33株阳性NRP-1过表达转基因单克隆细胞系,用于体细胞核移植的研究。通过核移植得到154枚转基因克隆胚胎,并移植到55只受体羊中。虽然未得到阳性转基因羔羊,但是上述结果对于阿尔巴斯白绒山羊转基因体系的完善及相关动物模型的建立提供了实验依据。2.NRP-1相关次级毛囊信号通路的研究由于阿尔巴斯白绒山羊生长周期较长,在建立NRP-1过表达阿尔巴斯转基因白绒山羊过程中,同步研究了NRP-1在次级毛囊中的信号通路。在次级毛乳头细胞中利用NRP-1沉淀与NRP-1相互作用的蛋白,通过SDS-PAGE电泳进行蛋白分离。经过考马斯亮蓝染色观察蛋白条带,利用蛋白质质谱分析检测的方法鉴定蛋白的结构。通过查阅文献和数据库分析,得到Prdx2和CAT是有可能与NRP-1相互作用的蛋白。通过哺乳动物双杂交系统确认NRP-1与Prdx2存在相互作用的关系。并运用荧光实时定量PCR联合蛋白免疫印迹法确认NRP-1与Prdx2 RNA与蛋白质表达量存在正相关关系。本实验在已知NRP-1对VEGF通路有影响的前提下建立了过表达转基因绒山羊模型的技术路线。初步探索了NRP-1在VEGF通路中的作用,筛选和鉴定了与NRP-1相互作用的蛋白,为与次级毛囊生长有关信号通路的作用机制研究提供了新的理论基础和实验依据。