球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是经典的丝状昆虫病原真菌,被广泛用于农林害虫的生物防治。基于球孢白僵菌的制剂在田间应用中常遭受高温、阳光紫外辐射、化学农药等环境因子的胁迫制约,影响其生物防治潜能的发挥。除了环境胁迫因子,生防真菌在进入昆虫体内后还会遭遇到由寄主细胞免疫应答所引起的胁迫。因此,开展白僵菌抗逆生物学研究,揭示抗逆性状的分子基础及其对生防潜能的影响,是合理应用生防真菌制剂防治农林害虫的科学依据。在田间环境及宿主体内双重胁迫作用下真菌细胞不可避免地被活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)损伤。谷氧还蛋白-谷胱甘肽氧化还原酶系(Glutaredoxin-Glutathione Reductase, GRX-GLR)及硫氧还蛋白氧化还原酶系(Thioredoxin-Thioredoxin Reductase,TRX-TRR)是真菌及其重要的抗氧化机制,是抵御ROS损伤含硫生物大分子的主要屏障。然而,这两大抗氧化酶系在昆虫病原性丝状真菌中的生物学功能目前知之不多。因此,研究这两大酶系内部的相互作用及其与超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)及抗氧化小分子谷胱甘肽(Glutathione, GSH)之间的互作关系,对于理解GRX-GLR及TRX-TRR保护直菌细胞的作用和机理,进而明确它们对真菌生防潜能的贡献,具有重要的意义。此外,细胞膜结构对于维持细胞存活状态及正常功能发挥具有决定性作用。内吞标志性位点(eisosome)作为重要的细胞膜结构域,具有稳定细胞构象、应答及传递胞内外环境信号、摄取营养元素等重要作用。Pil1和Lsp1是两个主要的组装蛋白,参与内吞标志性位点的构建。因此,本研究包含三个方面的工作,一是研究GRX-GLR酶系抗逆生物学功能及其对毒力的贡献,二是解析TRX-TRR酶系功能及其可能的互作关系,三是就Pill/Lsp1噬调控作用及其生防潜能影响开展了较详尽的研究。主要研究内容及成果分述如下球孢白僵菌GRX-GLR酶系的抗氧化功能解析谷氧还蛋白酶(Grx)是负责调控胞内硫醇-二硫化物氧化还原的一类蛋白,与硫氧还蛋白酶系具有重叠且又有所区分的生物学功能。球孢白僵菌拥有五个GRX家族成员(Grxl-5)和一个谷胱甘肽还原酶(Glr)。根据保守位点的不同,五个GRX成员可分为三类,即二硫醇谷氧还蛋白Grxl(保守活性位点为CPY/FC),单硫醇谷氧还蛋白Grx2-4(活性位点为CGFS或CS/PYS)以及类似谷氧还蛋白的蛋白Grx5(活性位点为CPDC)。grx 或 glr的单基因缺失,在正常条件下一般可通过其余同伴基因的转录上调而得到补偿。最特别的是grx3,它的转录上调可补偿氧化胁迫条件下grx1、grx2、grx5或glr的缺失,而它自身的缺失在正常条件下只能靠不可敲除的grx4的转录上调而得到补偿,或是靠其余同伴基因的转录上调而应对甲萘醌的氧化胁迫。结果是细胞氧化还原状态受干扰的程度以Aglr为甚,其次是Agrx3,但在其余grx敲除株中受干扰不明显。正常培养条件下的SOD总酶活是Agrxl-3敲除株显著高于野生株,但在甲萘醌胁迫下SOD总酶活是Agrx5和△glr敲除株显著低于野生株。不管有无过氧化氢胁迫,各敲除株的CAT总酶活都有不同程度的上升,而POD总酶活在Aglr中的下降幅度大于Agrx3。在胁迫应答中,△grx3仅对上述两种氧化剂敏感性有所上升,△glr不仅对上述两种氧化剂而且对硫醇氧化剂和硫醇还原剂的敏感性都有所上升。有趣的是,所有敲除株都对Fe3+更敏感,并伴随两个Fe3+转运蛋白基因的转录上调。生防潜能相关表型在除Agrx5之外的敲除株中都或多或少地有所改变。敲除株的所有变化都在回补株中恹复到野生株的水平。结果表明,在球孢白僵菌依赖于Glr的氧还系统与SOD、CAT、GSH-POD抗氧化酶系的互作关系,Grx3在系统中扮演着比其余同伴更为关键的角色。球孢白僵菌硫氧还蛋白的功能解析硫氧还蛋白(Trx)具有还原硫化物、为二硫化物的还原过程提供电子等功能。通过这一还原功能,Trx能够保护细胞免受ROS的损伤。球孢白僵菌拥有比其他真菌更多的硫氧还蛋白家族成员(Trx1-6)。通过在野生菌株中表达融合蛋白Trxx::eGFP(x=1,2,…,6)并对转基因细胞进行特异性染色分析,证明Trx1-4、Trx5及Trx6分别定位在细胞质、细胞核膜及线粒体中。各Trx的单基因敲除导致其他家族成员的转录水平明显上调,说明六个家族成员之间至少存在转录水平上的互补效应。与野生株相比,只有Atrx2对甲萘醌的敏感性显著上升,而包括Atrx2在内的所有trx敲除株对H2O2的响应都无变化。有趣的是,将trx敲除株与甲萘醌共培养,SOD总酶活仅在Atrx2中表现剧烈下降。与此同时,菌丝细胞内还原/氧化型谷胱甘肽比率在Atrx2中仅有0.4,而在包括野生菌在内的其他受试菌株中比值维持在1.0上下。除此之外,产孢、萌发、耐热、耐紫外以及毒力等生防潜能相关性状在所有敲除突变株中都有或多或少的改变。两个硫氧还蛋白还原酶(Trrl/2)的功能解析及其作用的Trx成员 硫氧还蛋白还原酶Trr通过招募还原性辅酶NADPH使其自身获得将氧化型Trx还原的能力,并与之组成硫氧还蛋白氧还酶系统。在酵母细胞中,Trx与Trr根据亚细胞定位分区而自然配对。但球孢白僵菌拥有都定位于细胞质的Trrl和Trr2同源蛋白,但各自与六个Trx成员之间的靶向关系不明。虽然trr2缺失导致部分trx基因转录上调,但trr1缺失引起更多trx基因的转录上调且幅度更大,而且仅有trrl的缺失时才诱发半胱氨酸营养缺陷、Trx总活力上升、POD及SOD总酶活下降等重要变化。有趣的是,在△trrl中超表达trx1、trx6或trr1时,上述表型缺陷被完全回复,而超表达trx23/4/5或trr2都无法挽救细胞的上述缺陷。这些结果意味着,Trr1可能通过还原Trx2-5而在白僵菌硫氧还蛋白氧还系统中发挥着主导作用,Trr2可能还原Trx1和Trx6而起着系统备份的作用。两个内吞标志位点蛋白(Pill与Lspl)对球孢白僵菌的细胞自噬与生防潜能的调控作用细胞膜在细胞生长、营养摄取以及胞内外信号接收、传递等方面起着举足轻重的作用。内吞标志位点(eisosome)是定位于质膜且标有内吞位点的大型杂合蛋白复合体,能够容纳脂质、转运蛋白、信号分子等,因而是细胞膜正常行使功能所必不可少的。球孢白僵菌的内吞标志位点中有Pill及Lspl两个主要结构蛋白,均定位于膜下侧的细胞周质,且呈不连续的斑点状。尽管二者共同定位在内吞位点的标志性结构域上,但各自的定位不需互为前提,这明显区别于酿酒酵母中Pill的正确定位是Lsp1定位在结构域上进行组装所必须的。在白僵菌中,pil1的缺失能刺激细胞自噬,导致囊泡中的自噬体显著增大,而lsp1的缺失却完全抑制细胞自噬发生,导致在囊泡中无法形成自噬体。这些观察与21个自噬基因的转录表达水平基本一致,即在△pil1表现为全面上调,而在△lsp1中绝大多数自噬基因的表达却大幅下调,尤以自噬前体形成最密切的atg8在△lsp1中下调幅度最大。显然,Pill和Lsp1具有直接或间接调控转录因子继而调控细胞自噬体形成及状态的功能,分别起着负向和正向调控细胞自噬的作用。作为膜结构相关蛋白,pil1和lsp1的缺失还引发细胞对多种胁迫应答的显著相反变化。有趣的是,所有这些变化在双敲除菌株中都表现为朝野生株方向回复的趋势。此外,二者的单基因敲除株和双敲除株的产孢能力、孢子活力、耐高温及抗紫外辐射等生防潜能相关性状,都发生显著不同的变化,侵染昆虫的能力则严重受损,尤以双敲除株受损最严重。结果表明,Pil1及Lsp1通过负向和正向调控细胞的自噬过程而影响胞膜、胞壁的结构与功能,因而是维系球孢白僵菌生防潜能所必须的。