研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后,心肌细胞缺血坏死,心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及炎性细胞分泌大量细胞外基质替代心肌细胞,进而心室结构和功能发生相应改变,引起心肌纤维化,导致心室重构,这个过程能够影响心肌梗死患者预后。病理性心室重构的基本特征是心肌成纤维细胞的异常聚集和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的过度沉积。在MI的发生和发展过程中,组织中众多细胞因子将不同来源的心肌成纤维细胞招募至损伤区域,合成和分泌大量以Ⅰ、III型胶原蛋白为主的细胞外基质,这些细胞外基质与原有心肌细胞之间相互作用,维持心脏结构和功能的稳定。然而,细胞外基质的过度聚集和沉积,在心肌梗死晚期修复中能够引起心肌纤维化,导致心功能不全。心肌纤维化的调控是改善心肌梗死患者预后的关键因素之一。心肌成纤维细胞是心脏中重要的一类细胞,参与心肌梗死后心脏组织收缩和心肌电生理活动的维持。与其他器官不同的是,心脏损伤后的再生能力有限,其修复过程涉及坏死的心肌细胞被清除,瘢痕组织置换原有的心肌细胞。这种修复方式能够保持心脏结构和功能一定的稳定性。与此同时,在心肌细胞损伤后,心肌成纤维细胞发生表型转化,表达收缩蛋白和α-平滑肌肌动蛋白,转化成为肌原性细胞表型,分泌Ⅰ、III型胶原及胶原交联分子,最终导致心肌纤维化。肾素-血管张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)在心脏血管结构改变时被激活,参与心肌和血管修复,与MI后心肌纤维化有直接关系。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS中的主要活性物质。研究表明,与正常组相比,MI患者组心肌组织中Ang II水平明显升高,提示Ang II参与心肌梗死后心肌微环境改变以及心肌组织修复。Ang II能够作用于心肌成纤维细胞,促进心肌成纤维细胞增殖、迁移、表型转换、胶原蛋白的合成和胶原的交联,最终诱导心肌纤维化的形成。因此,Ang II可作为诱导因子之一可模拟、构建心肌梗死后局部微环境。本实验拟采用Ang II刺激人心肌成纤维细胞,模拟心肌梗死后局部心脏微环境,研究心肌梗死后心肌纤维化相关机制。在参与调节ECM稳态代谢的细胞因子中,与ECM积聚关系最为密切的是转化生长因子β(Transforming growth factor,TGFβ)家族。RAAS和TGFβ家族之间具有许多联系,例如,Ang II能够在多种细胞中促进TGFβ的合成。在多种病理生理学效应中,TGFβ作用于Ang II下游,参与Ang II对生物功能的调节。心室重构中,TGFβ的作用在一定程度上是通过Ang II介导的。TGFβ3定位于人类第14号染色体,在细胞的生长发育中具有重要作用,具有抗组织纤维化的作用。在心肌梗死的发生和发展中,TGFβ1在梗死后6小时开始分泌,72h达高峰,而TGFβ3在梗死后48小时开始分泌,32天达到高峰。这提示TGFβ3能够通过参与的心肌细胞基质抑制性代谢活动对抗心肌纤维化,在纤维化后剩余心肌过度收缩导致的心脏破裂中起一定的作用。TGFβ有3种类型受体,Ⅰ型(TβR-Ⅰ)(又被称为ALK5)、Ⅱ型(TβR-Ⅱ)和Ⅲ型受体(TβR-Ⅲ),为跨膜糖蛋白受体。Smad蛋白是TβR-Ⅰ的直接作用底物之一,是能够将TGFβ与TβR相互作用的信号从胞浆传递到细胞核内的中间介质。活化的Smads进入核内后与其他转录因子一起共同参与靶基因的转录。研究显示,TGFβ3能够促进肝星状细胞中smad7的表达。因此,推测TGFβ3可能通过活化smad7从而抑制胶原的表达。在心脏中,心肌成纤维细胞已经被确认为合成和分泌胶原的主要细胞。前期实验中,我们检测到在心肌梗死组织中TGFβ3表达水平增高,因此,本课题拟以人心肌成纤维细胞为对象,通过组织学染色、ELISA、细胞培养、细胞增殖和迁移实验、细胞毒性实验、细胞转染、细胞免疫荧光、蛋白印迹(Western blot)等方法,研究TGFβ3对心肌成纤维细胞的作用及其相关分子机制,进一步探讨TGFβ3在拮抗心肌纤维化过程中的作用和机制,为心肌纤维化后心室重构的临床治疗提供理论依据。结果显示:1、MI导致心肌组织中TGFβ3表达持续性增加;2、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成;3、TGFβ3促进人心肌成纤维细胞表达LOX、OPN和α-SMA;4、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞中TGFβ/smad信号通路的磷酸化水平;TGFβ3通过上调TGFβ/smad信号通路中smad7蛋白的磷酸化水平调节心肌成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成。结论:TGFβ3通过调节TGFβ/smad信号通路中smad7从而抑制心肌梗死后心肌重构。