寄生性线虫在全球范围内广泛流行,尤其是其中的捻转血矛线虫,为严重危害反刍动物的寄生性线虫之一。尽管使用驱虫药能较好地控制此类线虫,但虫体的耐药性问题却越来越不容忽视。对于虫体的耐药性问题,限于研究方法,目前仍十分缺乏系统的耐药性现状和耐药机理方面的资料。鉴于此,本研究拟以耐伊维菌素捻转血矛线虫作研究对象,在获得虫体和虫卵蛋白的基础上,对其中所含蛋白质进行Shot-gun LC MS/MS分析,以发现与耐药性相关的蛋白,具体结果如下:(1)捻转血矛线虫虫卵裂解方法的筛选先以糖盐水漂浮法获取捻转血矛线虫虫卵,再分别以酶解法、反复冻融法、强酸强碱液法以及酶解与反复冻融结合法裂解虫卵,然后在镜下观察虫卵结构和计数未裂解虫卵数,并以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证裂解效果。最终确定当1mL虫卵悬液中加入2mL几丁质酶溶液作用45min,再将虫卵悬液放入液氮中冻存30min,然后取出于50℃水浴6h,反复3次,虫卵裂解效果最好,裂解率为93%。(2)捻转血矛线虫虫体裂解方法的筛选对捻转血矛线虫三期幼虫,分别以液氮研磨法、反复冻融法、脱鞘后液氮研磨法以及脱鞘后反复冻融法裂解幼虫虫体,结果显示脱鞘后液氮研磨法为幼虫破碎的最佳方法,虫体裂解效果明显,裂解率为1 00%。(3)捻转血矛线虫虫卵与幼虫蛋白质Shotgun LC MS/MS分析由捻转血矛线虫虫卵和幼虫蛋白质Shotgun LC MS/MS分析得知,共鉴定得到蛋白质528个,其中捻转血矛线虫耐药株幼虫特有蛋白16个、敏感株幼虫特有蛋白2个和虫卵特有蛋白192个,敏感株虫卵与敏感株幼虫共同蛋白质为4个,敏感株虫卵、敏感株幼虫和耐药株幼虫共同蛋白有30个。这些蛋白主要参与虫体的蛋白水解、代谢、转录、离子输运、电子转运、分子结合、蛋白质折叠和信号转导等过程。同时,还发现4种蛋白质-肽酶C2域蛋白质、组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]和肌动蛋白与虫体的耐药性相关。(4)捻转血矛线虫体蛋白质的Western-blot分析根据Western-blot结果显示,捻转血矛线虫虫体蛋白出现特异性条带,大小在14-120KDa之间,证实了不同虫株、不同阶段虫体体内蛋白存在差异,且部分蛋白具有良好的反应性,并能够被绵羊血清所识别。上述结果的取得为捻转血矛线虫的发育、感染、免疫逃避、疫苗抗原和药物靶点的筛选及耐药机制等的研究提供了重要基础信息,也使阐明耐药性的分子背景,进而揭示耐药性产生机制更进了一步。