土壤放线菌11-9-3的鉴定及其代谢产物杀虫活性成分研究

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微生物的次生代谢产物是重要的天然产物资源,通过对微生物次生代谢产物进行结构修饰或衍生而开发新型药物,是现今新农药研发与天然产物研究的主要方向之一,其中放线菌是重要的生物活性物质产生菌,目前从微生物次生代谢产物发现的具有生物活性的30000多种天然产物中约有70%源自于放线菌,放线菌因其种类繁多、分布广泛,所产生的次生代谢产物结构新颖多样,因此从放线菌的代谢产物中发现新的活性物质为新农药的开发以及新先导化合物的研发提供基础。本研究对几株分离自气候条件多变土壤状况复杂的青藏高原和内蒙古地区、具有一定农用活性的土壤放线菌发酵液进行杀虫活性筛选,筛选出一株具有显著杀虫活性的土壤放线菌11-9-3,为了进一步明确菌株11-9-3的杀虫活性成分,本研究对该菌株进行了较为系统的研究,对该菌株的代谢产物进行了活性成分的分离、鉴定以及活性评价,同时对该菌株进行了分类鉴定。主要结果如下:(1)采用玻片浸渍法与浸虫浸叶法,以小菜蛾(Plutella xylostella)、朱砂叶螨(Tetranychina harti)、粘虫(Mythimna separata)、苹果黄蚜(Aphis citricola Van der Goot)为试虫,分别对实验室保藏的7株土壤放线菌发酵液进行了杀虫活性筛选,结果表明:11-9-3、11-9-49、12-9-10、11-12-1、11-12-2对朱砂叶螨具有明显的毒杀活性,24h校正死亡率均高于60%,而11-9-3、12-9-10对红蜘蛛的毒杀活性最好,24h校正死亡率高达80%;11-9-3、11-9-49、12-9-10对于苹果黄蚜的毒杀活性较好,24h校正死亡率高于50%,而11-9-3对苹果黄蚜的毒杀活性最好,24h校正死亡率达到了70%;7株放线菌发酵液对粘虫的毒杀活性较低,无明显的毒杀活性,72h死亡率均低于20%;7株放线菌发酵液对小菜蛾的毒杀活性差异显著,其中12-9-26、12-9-27的72h校正死亡率低于20%,11-9-49、12-9-10的72h校正死亡率高于50%,而11-9-3对小菜蛾的毒杀活性最为显著,72h校正死亡率达到了90%。11-9-3的发酵液表现出了显著的杀虫活性,进一步定量测定了该菌株4个极性段粗提物杀虫活性,结果显示乙酸乙酯粗提物与氯仿粗提物(20mg/ml)对小菜蛾的毒杀活性最好,72h校正死亡率高于90%,因此可确定活性物质集中在氯仿段与乙酸乙酯段内。(2)采用多相分类学方法,通过对11-9-3菌株进行形态学特征观察及生理生化特征分析,结合菌株的16S rDNA序列与特征菌株的比对分析和系统发育树的构建,可基本确定菌株11-9-3属于链霉菌属(Streptomyces)。通过序列比对,放线菌11-9-3菌株与吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)在同一系统进化分支上,相似度达到了98%,其形态特征、培养特征也与吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)相似,但是其生理生化特征却与典型的吸水链霉菌存在较大差异,因此11-9-3可能为吸水链霉菌的新亚种,其分类地位的确定还需进行DNA-DNA杂交以及细胞壁化学成分比较。(3)对菌株11-9-3进行大量发酵,收集上清液经萃取浓缩后得到氯仿段粗提物与乙酸乙酯段粗提物,采用活性追踪法结合硅胶柱层析、凝胶柱层析、薄层层析、HPLC等多种分离手段分别对11-9-3菌株的氯仿活性段以及乙酸乙酯活性段粗提物进行进一步分离提取,最终得到了8个化合物,利用核磁氢碳谱等波谱分析方法结合文献分析比对,鉴定出了6个化合物,分别为:4-Hydroxybenzoic acid(A)、环(L-脯氨酸-L-亮氨酸)二肽(B)、1-acetyl-4,5-dihydroxyanthracene-9,10-dione(C)、1,8-dihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dione(E)、Convolvulol(I)、环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)二肽(D),C、E均为蒽醌类化合物,B、D均为环二肽类化合物,I为苯并呋喃类化合物。(4)对分离得到6个化合物进行了初步的杀虫活性研究,分别测定了化合物对苹果黄蚜、朱砂叶螨、小菜蛾、粘虫的毒杀活性、对粘虫的拒食活性、对小菜蛾的生长抑制作用,结果显示:筛选出了两个对朱砂叶螨具有较好毒杀活性的化合物C(致死中浓度LC50为756.46μg/ml)和化合物E(LC50为389.79μg/ml),以及对粘虫有一定拒食活性的化合物I,拒食率为44%。
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