一、研究目的及意义 细胞色素P450参与药物在肝内降解的第Ⅰ相反应。据估计60％普通处方药需要通过细胞色素P450系统进行生物转化。肝脏微粒体的细胞色素P450酶系统是促进药物生物转化的主要酶系统，故又称肝药酶。其CYP1、2、3家族是参与药物代谢的主要酶系。猪作为一种具有重要应用前景的药物评价动物及医学生物学实验动物，其P450基因的研究还相对缺乏。尽管，目前猪EST数据库中的序列数已达到154万多条，已命名的P450基因59个(CYP2F，CYP2G，CYP2T，CYP2U1，CYP2W1，CYP2AB1和CYP2AC1未发现)，但通过国际细胞色素P450命名委员会命名的基因中仅有30个功能基因。公开数据库中海量增长的序列信息为我们发现新基因提供了充足的资源。基于EST作为基因的部分cDNA序列，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术发现和克隆新基因已成为获取新基因和进行功能研究的重要途径。研究已表明小型猪的P450系统和人具有类似的含量和活性，将其作为药物代谢模型具有一定的可行性。但是，其各单酶的代谢特性研究还相当缺乏，获得其基因及编码区序列是研究其单酶代谢特性的基础条件。为研究小型猪的药物代谢特性，和将其作为药物代谢实验动物模型的可行性提供资料和依据，本研究以我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏为实验材料，结合前期的工作，首先，根据所预测的CYP3A88、CYP2R1、CYP2C91、CYP1A2基因片段序列设计引物，以肝脏总RNA为模板进行RT—PCR对预测片段进行验证，根据验证结果进一步利用RACE技术克隆并鉴定其全长cDNA序列，对得到的序列进行生物信息学分析，同时与人和其他动物进行对比研究。 二、研究内容和结果 1.研究内容：(1) RT—PCR及RACE方法克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88、CYP2R1、CYP2C91、CYP1A2全长cDNA序列。(2)生物信息学方法分析巴马香猪CYP3A88、CYP2R1、CYP2C91、CYP1A2序列，并预测其结构和功能，同时与人及其他动物的序列进行对比研究。 2.基因克隆结果。(1)CYP3A88克隆结果：首先，克隆到CYP3A88基因片段序列608bp，与所预测序列一致，提交至NCBI，GenBank登录号为EF625347，国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP3A88；其次，成功克隆并鉴定了CYP3A88全长cDNA序列，长度为1，999 bp，其中编码区长为1，512bp，编码503个氨基酸，其成熟蛋白分子式为C2617H4092N672O721S23，相对分子质量为57.243 KD；NCBI上已提交的小型猪CYP3A39v2(GenBank登录号：EF625354)，CYP3A46(GenBank登录号：AB052266.1)实为CYP3A88的两片段，它们三者为同一基因。(2)CYP2R1克隆结果：首先，克隆到CYP2R1基因片段序列996bp，与所预测序列一致，提交至NCBI，GenBank登录号为EF625346，国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP2R1；成功克隆并鉴定了其全长cDNA，并获得两个转录本，一个大小为2，005 bp，其中编码区长为1，506bp，编码501个氨基酸，其成熟蛋白分子式为C2620H3998N670O717S20，相对分子量为56.996 kD，一个经外显子遗漏剪接后全长为1，675 bp，编码区长为1，176 bp，编码391个氨基酸。(3)CYP2C91克隆结果：克隆到CYP2C91基因序列606bp，与所预测序列一致，提交至NCBI，GenBank登录号为EF625345，国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP2C91；RACE PCR成功克隆到其完整3’端908bp序列，与已知序列拼接得到一个长为1，357bp的3’端序列。(4)CYP1A2克隆结果：克隆到CYP1A2基因片段序列389bp，与所预测序列一致，提交至NCBI，GenBank登录号为EF625344，国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP1A2；RACEPCR成功克隆到其完整3’端561bp序列，与已知序列拼接得到一个长为621bp的3’端序列。 三、序列分析结果 (1)CYP3A88序列分析结果：一级结构分析，比较核苷酸序列，小型猪CYP3A88与本亚家族成员CYP3A39相似性高达94％，而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86％以下；推导和分析氨基酸序列表明，与小型猪CYP3A其它成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进行对比，其相似性分别为92％，89％，80％，而将小型猪与人的CYP3A分别比对，小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高，为77％；经跨膜区域预测，共有5个跨膜区段，由内向外的区域分别在175～191，213～233，295～314，383～401 aa处，由外向内的区域分别在7～28，430～457 aa处；对其二级结构预测，它可能含12个α螺旋，4个β折叠；经NCBI上的CDD程序分析可知，其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域；经聚类分析，小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系；通过同源建模法对其在线建模，人CYP3A4晶体结构作为其模建模型，得到了其经典的三维结构；电子表达谱分析表明：每100万个转录产物中，CYP3A88在猪的各个器官中表达情况为：脂肪组织53，血管30，小肠246，肝脏76，肺85，输卵管327，胰腺231，胎盘54。另外，CYP3A88只在成年猪体内表达，其他年龄阶段均不见表达。 (2)CYP2R．1序列分析结果:一级结构分析，CYP2R1氨基酸序列表明，正常转录本与人CYP2R1相似性高达94％，与小鼠相比，其相似性为88％；经跨膜区域预测，共有7个跨膜区段，由内向外的区域分别在38～61，179～197，223～241，314～336，456～473 aa处，由外向内的区域分别在9～27，363～383 aa处；对其二级结构预测，主要是α螺旋(46.31％)，其次是随机卷曲(36.73％)，还有11.38％的延伸链和5.59％的β—转角；经NCBI上的CDD程序分析可知，其49～501氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域，剪接本也存在相应保守结构区域；经聚类分析，较其他动物，小型猪CYP2R1与人的进化关系最近；通过同源建模法对其在线建模，人CYP2R1晶体结构3czh的B链作为其模建模型，得到了其经典的三维结构，而发生剪接的小型猪CYP2R1因无法获得模型而未能构建其三维结构。 (3)CYP2C91序列分析结果:经3RACE扩增所得序列长为909bp，与已知片段拼接得到一个长为1，357bp的序列，包含3非编码区在内，其中polyA长度为28 bp。将该序列Blastx发现，其与牛CYP2C19(GenBank登录号：NM001109792)存在54％相似性，据此，找出其最可能的阅读框发现，在编码区内多次出现终止子，无完整的阅读框，3末端有多聚腺嘌呤，符合已加工假基因的特点。 (4)CYP1A2序列分析结果：经3RACE扩增所得序列长为561bp，与已知片段拼接得到一个长为621bp的序列，包含3’非编码区在内，其中polyA长度为21bp。将该序列Blastx发现，其部分序列与NCBI上提交的猪CYP1A2相似基因(GenBank登录号：XM001927822.1)存在99％的相似性，与人CYP1A2(GenBank登录号：BC067427)存在86％相似性，据此，找出其最可能的阅读框发现，在编码区内出现2次终止子，无完整的阅读框，3ˊ末端有多聚腺嘌呤，符合已加工假基因的特点。 四、研究结论 1.成功获得巴马香猪CYP3A88全长序列，其在序列和高级结构上均与人CYP3A4最为相似，并且只在成年猪体内有表达 2.成功获得巴马香猪CYP2R．1全长序列，并发现其两个转录本，正常转录本在序列和高级结构上均与人CYP2R．1最相似，且与人的进化关系也较其他动物近 3.成功获得巴马香猪CYP2C91、CYP1A23’端完整序列，其很可能是巴马香猪药物代谢P450新增的两假基因，在肝脏组织内呈低表达或不表达