背景职业性肿瘤是指在生产过程中接触致癌因素所引起的肿瘤。职业性肿瘤多见于皮肤、呼吸道及膀胱,也可见于肝脏及血液系统。由于皮肤和呼吸道是职业性致癌物进入机体的主要途径和直接作用的部位,因此职业性肿瘤最多见于皮肤和呼吸系统。职业性肺癌占职业性肿瘤的大部分,对人类致癌的63种化学物质中,与职业有关的大约有35种,其中25种与肺癌有关。在全世界范围内,肺癌是男性癌症死亡的首要原因,女性癌症死亡的第二原因,在2008年约有1.6万个新发肺癌病例,1.4万人死于肺癌。超过80%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC),而小细胞肺癌(SCLC)只占20%[2]。值得注意的是,中国的男性和女性肺癌的发病率超过许多欧洲国家的妇女肺癌发病率。NSCLC早期无明显症状,因此就诊时约70%的患者已属中晚期,失去了手术机会；即便可手术的晚期的患者五年生存率也低于50%,因此化疗就显得尤为重要。顺铂(cis-diehlorodiamine platinum, CDDP, cisplatin)是铂的金属络合物,是一种常用的化疗药物,主要是通过破坏DNA复制而发挥细胞毒作用。顺铂被广泛应用于包括非小细胞肺癌在内的不同类型肿瘤,对肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤及生殖细胞肿瘤都有治疗功效。顺铂主要通过与细胞DNA发生不同类型的反应导致DNA损伤。与细胞的DNA形成加合物的最终结果通常导致细胞凋亡。但顺铂诱导DNA损伤到引起细胞凋亡的具体分子机制仍不清楚。顺铂延长非小细胞肺癌(NSCLC)的生存率,并已成为治疗膀胱癌、宫颈癌、头部和颈部癌症、食道癌,小细胞肺癌(SCLC)以及几种小儿恶性肿瘤的主要药物。顺铂在睾丸,膀胱癌和头颈部肿瘤中仍优于卡铂。但是顺铂引起凋亡的具体机制还不清楚。基质相互作用分子1 (STIM1)被定义为内质网(ER)钙浓度感受器,在非兴奋细胞控制钙池操纵钙进入(SOCE)和钙释放激活钙通道(CRAC),进而控制细胞内游离钙离子稳态。STIM1大部分定位在细胞内的钙库-内质网上[8,少部分存在于细胞膜上。细胞内钙([Ca2+]i)是兴奋和非兴奋细胞的第二信使和信号转导分子,是调节程序性细胞死亡的一个重要因素。一些研究表明,在细胞凋亡过程中细胞内游离钙离子的浓度增加。内质网钙释放以及Ca2+通过Ca2+释放激活钙离子通道内流可诱导细胞凋亡[14-16]。然而,Magnelli等发现细胞浆游离钙离子减少与细胞凋亡相关。而jayadev等人[18]报道,抑制SOCE可导致囊泡积累和细胞凋亡。Chen.Y.F等人发现,在肿瘤组织中的STIM1表达水平高于非肿瘤组织,且STIM1参与癌细胞的生长,迁移和血管生成。STIM1也是一种微管正端跟踪蛋白(EB1),参与内质网重塑,且STIM1的浓度与内质网-胞膜结点、Ca2+信号空间结构密切相关。而EB1在细胞周期中发挥调节微管动力学和极化的基础性作用。Jordan和Wilson证明一些抗癌药物通过阻止有丝分裂和诱导细胞凋亡而抑制细胞增殖。因此STIM1在细胞凋亡过程中可能通过调节细胞内游离钙离子稳态和干扰内质网的重建,最终导致细胞凋亡。到目前为止,只有少数研究探讨了在顺铂处理的细胞中细胞内Ca2+的动态平衡可能发挥的作用。而尚无关于STIM1在顺铂诱导非小细胞肺癌凋亡中作用的报告。本研究探索了STIM1在非小细胞肺癌组织和正常人肺组织的表达,从而探索STIM1的在非小细胞肺癌形成和发展中的作用。我们检测通过RNAi下调STIM1或者通过转染野生型STIM1质粒上调STIM1表达后,顺铂处理A549和H460细胞的凋亡情况。目的探索STIM1在非小细胞肺癌形成和发展中的作用；探索STIM1是否参与顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞株(A549和H460细胞)的凋亡。探讨STIM1通过何种机制参与顺铂诱导的非小细胞肺癌凋亡方法1.用免疫印迹检测非小细胞肺癌组织以及癌旁组织中STIM1的蛋白水平的表达情况；2.用免疫印迹的方法检测STIM1在非小细胞肺癌细胞A549和H460细胞株中的蛋白水平表达；用带荧光的二抗标记A549和H460细胞上STIM1蛋白,然后用激光共聚焦检测细胞活细胞上STIM1表达。3.不同浓度顺铂处理24h后A549细胞和H460细胞凋亡率的变化。细胞铺板24h后再用顺铂处理24h,收集细胞进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。4. hoechst33342染色观察顺铂处理后细胞形态的变化。细胞铺板24h后用15μM顺铂处理24h后,然后用hoechst33342对细胞进行染色,观察顺铂处理后细胞核的变化。5.用荧光定量PCR的方法检测顺铂处理后A549和H460细胞上STIM1表达的变化；免疫印迹的方法检测顺铂处理后A549和H460细胞上STIM1在蛋白水平的变化。6.通过siRNA干扰下调A549和H460细胞上STIM1的表达；转染野生型STIM1质粒,上调A549和H460细胞上STIM1的表达；用免疫印迹检测siRNA的干扰效率和STIM野生型过表达后的过表达效率。7.流式细胞仪的方法检测STIM1过表达和干扰后细胞凋亡率的变化8. Flour-4-AM标记钙离子,免疫荧光检测顺铂处理后细胞内钙离子浓度的变化。9. SOCE通道非特异性阻断剂2-APB和SKF96365预处理细胞2h抑制细胞钙离子通道。结果1. STIM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺部组织。用免疫印迹检测22例非小细胞肺癌病人的肺癌组织以及癌旁正常组织的病例标本上STIM1的蛋白表达,结果显示16例病人样本在肺癌组织中与正常肺组织中存在差异,即有72.72%的病例STIM1在肺癌组织中表达高于正常肺组织。2.免疫荧光和免疫印迹结果显示STIMl在人非小细胞肺癌细胞株A549和H460都表达,且主要存在于胞浆中。3.不同浓度的顺铂处理非小细胞肺癌细胞24h后,收集细胞检测细胞凋亡率,结果显示顺铂可诱导A549和H460细胞凋亡,且有浓度依赖性；4. Hoechst33342染色检测顺铂处理非小细胞肺癌细胞后细胞核形态的变化。从形态学方面进一步证实顺铂可诱导非小细胞肺癌细胞凋亡,我们用15gM顺铂处理细胞24h后用hoechst33342染细胞核。倒置荧光显微镜观察到A549细胞和H460细胞的细胞核出现染色质聚集、DNA断裂、核固缩等现象,并形成典型的凋亡小体。进一步说明15μM顺铂可以诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡。5.用顺铂处理A549和H460细胞后,两种细胞株上STIM1的mRNA表达水平和蛋白水平表达都发生下降。6. siRNA干扰STIM1的表达后,用免疫印迹的方法检测干扰效率,数据结果表明A549细胞上STIM1的干扰效率大于60%,H460细胞上STIM1的干扰效率大于70%；STIM1干扰后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,结果显示STIM1干扰后细胞的凋亡率增加。7.将空质粒和STIM1野生型质粒分别转染到非小细胞肺癌细胞中,免疫印迹结果显示,在A549细胞上转染效率为161%,在H460细胞上转染效率为211%; STIM1过表达后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率变化,结果显示STIM1过表达后细胞凋亡率减少。8.顺铂处理后免疫荧光检测细胞内钙离子的变化,结果显示：顺铂处理使细胞出现瞬时的钙离子下降。且上调或者下调细胞内STIM1的表达都不能逆转这种抑制作用。9.用钙通道抑制剂2-APB和SKF96365预处理细胞2h后,用15μM的顺铂处理细胞,结果出现与STIM1表达下调同样的结果。钙离子抑制剂预处理组顺铂诱导的凋亡率明显高于无钙离子抑制剂处理组顺铂诱导的凋亡率。结论1. STIM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于人体正常肺部组织,且在A549和H460细胞上表达,STIM1可能参与非小细胞肺癌的形成和发展,或其抑制癌细胞死亡或凋亡的作用。2.顺铂可诱导非小细胞肺癌细胞A549和H460凋亡,有浓度依赖性。3.顺铂处理后导致细胞内STIM1的mRNA和蛋白水平表达量的下调,顺铂可能通过抑制STIM1的mRNA表达,进一步抑制STM1的蛋白表达,最终导致细胞凋亡。4. STIM1干扰后顺铂诱导的细胞凋亡率升高,而STM1过表达导致顺铂处理细胞的凋亡率下降,进一步证明STM1通过表达量改变参与顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡。5.顺铂处理导致细胞内钙离子浓度出现瞬时下降,说明顺铂可能通过抑制STIM1的功能而干扰细胞内的钙稳态。6.钙通道抑制剂处理增加细胞的凋亡率,进一步证明顺铂通过抑制STIM1的表达和功能的发挥,进而干扰细胞内钙稳态,最终引起细胞凋亡。