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乙草胺(Acetochlor)是最具代表性的三大除草剂(草甘膦、丁草胺和乙草胺)之一,在我国生产量和使用量巨大,有不易挥发、光解缓慢、土壤持效期长等特点,除此之外,它还具有直接毒性,长期大量施用具有潜在的生态与环境安全隐患。因此,对其进行的微生物降解研究也逐渐成为热点。 本研究的主要目的是从长期使用乙草胺的土壤中筛选获得能够高效降解乙草胺的微生物,对其进行种属鉴定;探明菌株的生长特性和对乙草胺的降解特性,并对菌株的菌剂生产和实际应用做初步研究。主要研究结果如下: 1、以乙草胺为唯一能源,从长期施用乙草胺的农田土壤中分离到6株细菌,选择降解率最高的菌株,编号为L3。通过形态学观察、16S rDNA序列同源性分析、生理生化试验等方法,将菌株L3鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其16SrDNA基因序列在GenBank中的序列登录号为:KM573816。 2、通过探究L3的生长特性,绘制了其生长曲线,且菌株L3的最适生长培养基为:1%葡萄糖,0.25%蛋白胨,1mmol/L Ca2+(CaCl2·2H2O)和Mn2+(MnSO4·H2O);最适培养条件为:培养温度30℃,起始pH值8.0,装液量30mL/250mL三角瓶,180r/min恒温摇床振荡培养。在该最适条件下,菌株培养24h后,总菌量为1.15×1010CFU/mL。菌株L3在10~900mg/L的乙草胺浓度范围均可生长。 菌株L3降解乙草胺的最适条件为:温度37℃,pH8.0,接种量5%(v/v),装液量70mL/250mL三角瓶,180r/min恒温摇床振荡培养,在乙草胺初始浓度为50mg/L时,该最适条件下处理3d,菌株对乙草胺的降解率为52.98%,高于复筛时在普通培养条件下的52.01%。且菌株L3在3d内对乙草胺、丙草胺、丁草胺和异丙草胺均有一定的降解,对四种酰胺类除草剂的降解效果依次为乙草胺(51.86%)>异丙草胺(45.64%)>丙草胺(43.05%)>丁草胺(32.6%),说明菌株L3有较宽的降解谱。 3、运用单因素试验和正交试验对乙草胺降解菌剂的生产条件进行研究,确定了枯草芽孢杆菌L3的最优培养基组成:碳源1%乳糖,氮源3%玉米浆,无机盐0.1%NaH2PO4·2H2O;最优发酵条件为培养基起始pH值7.5,种龄20h,装液量30mL/250mL三角瓶,接种量5%(v/v),温度37℃,转速180r/min。此条件下芽孢形成率为97.1%,芽孢产量可达6.5×109CFU/mL。L3产芽孢发酵条件的优化为其菌剂制备和工业生产奠定了基础。 4、通过盆栽实验,考察了L3菌剂的实际应用效果。包括降解菌浓度和施用时间对土壤中乙草胺降解的影响,降解菌的施用对土壤中土著微生物量、酶活、物质量以及对敏感作物小麦生长的影响。结果表明,菌剂的适宜施用浓度为5×106CFU/g土壤,此浓度下,7、14、50d后乙草胺的降解率分别为24.24%、22.76%、86.93%;施用L3菌液对土壤微生物的种类和数量均有较大程度的恢复;并且明显降低了乙草胺对土壤蔗糖酶、脲酶、蛋白酶和过氧化氢酶的抑制作用,减轻了乙草胺对土壤全氮、有效磷和有效钾的破坏;施用降解菌液后,相比空白组,小麦地上部分增高117%,总鲜重增重56%,根长增长27%,表明菌株L3对污染土壤中敏感作物小麦的生长修复具有良好的效用,即该菌剂的使用可减轻因乙草胺残留所造成的下茬作物潜在危害。 5、应用平皿生化反应、薄层色谱法及分光光度法检测了菌株L3产生促生物质的能力。结果发现,菌株L3可产生嗜铁素、吲哚乙酸和一定量的小分子有机酸,其嗜铁素A/Ar比值为0.61,全部为羧酸型,吲哚乙酸的浓度为75.6mg/L。证实L3菌株在乙草胺污染土壤修复中具有多方面实际应用价值。 本研究最终分离到乙草胺高效降解菌Bacillus subtilis L3,并探明了其生长、降解特性和实际应用效果。