水牛睾丸支持细胞(Sertoli cells)以及其分泌物对于水牛精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)的增殖有重要的影响。支持细胞环绕在精原干细胞周围,为精原干细胞的正常生长提供稳定的空间,同时参与形成血睾屏障,保护精原干细胞环境的稳定,为精原干细胞的增殖提供物理支持,其分泌的生长因子如GDNF和FGF2等,对精原干细胞的增殖具有重要作用,FGF2是干细胞培养过程中重要组成成分,对于处在未分化状态的干细胞是必需的,并且对中胚层和外胚层来源的细胞具有促分裂作用。本论文探索了水牛支持细胞分离纯化方法,对比了幼牛及成年牛支持细胞中FGF2表达差异并观察了它们作为饲养层培养水牛SSCs的效果,构建了支持细胞FGF2过表达细胞系,以期为建立优化的水牛精原干细胞体外培养系统奠定基础。现将本论文的研究结果简述如下:第一章:开展了水牛睾丸支持细胞组织定位及分离纯化研究。研究结果显示:以anti-DDX4作为生殖系细胞特异性标记抗体,anti-WT1作为支持细胞特异性标记抗体,对水牛睾丸组织进行组织免疫荧光分析,发现青春期前水牛睾丸曲细精管靠近基底膜位置上的细胞胞质呈现DDX4阳性,而睾丸曲细精管靠近基底膜位置上细胞的细胞核呈现WT1阳性,定位结果与预期一致。接着利用差异贴壁法纯化水牛睾丸支持细胞,并在体外贴壁培养不同时间段收集细胞,利用real-time PCR及WB分析贴壁细胞和悬浮细胞相关转录本和蛋白表达情况,结果显示,体外培养1h至2 h或3 h至4 h两个时间段悬浮细胞wt1表达皆呈现显著降低趋势,而贴壁培养5 h的贴壁细胞wt1表达显著高于贴壁培养1h的贴壁细胞。对差异贴壁纯化后的细胞进行RT-PCR以及WB检测结果显示,纯化后细胞表达支持细胞的标记WT1、GATA4、SOX9,不表达间质细胞标记3β-HSD以及管周肌样细胞标记α-SMA,并且纯化后细胞WT1蛋白表达量高于纯化前细胞。第二章:开展了不同年龄水牛睾丸支持细胞FGF2表达差异及其对水牛SSCs培养效果影响的研究。利用real-time PCR分析成年水牛睾丸支持细胞与幼年水牛睾丸支持细胞相关转录本表达状况,发现成牛睾丸支持细胞FGF2及LIF表达显著高于幼年牛,而幼牛与成年牛睾丸支持细胞GDNF及SCF的表达差异不显著。以成年水牛及幼年水牛睾丸支持细胞作为饲养层共培养精原干细胞,幼年水牛支持细胞更有利于维持精原干细胞的增殖,与幼牛水牛睾丸支持细胞共培养的水牛精原干细胞PLZF、NANOS2、GFRα1表达显著高于成年水牛睾丸支持细胞共培养的精原干细胞。第三章:开展了构建FGF2基因过表达水牛睾丸支持细胞系的相关研究。使用PEGFP-N1质粒,构建PEGFP-N1-FGF2重组质粒,利用x-fect将重组质粒转染到支持细胞,并使用G418筛选,得出FGF2过表达细胞系。以体外正常培养水牛睾丸支持细胞为对照,将FGF2过表达支持细胞与精原干细胞共培养,与过表达FGF2细胞系共培养的精原干细胞OCT4、PLZF、GFRα1和NANOS2的表达量显著高于未转染细胞共培养精原干细胞。综上所述,使用差异贴壁法可成功纯化获得水牛支持细胞,幼年牛睾丸支持细胞作为饲养层更有利于水牛精原干细胞的体外增殖,成功构建过表达FGF2基因幼年牛睾丸支持细胞系,该细胞系作为饲养层有利于促进水牛精原干细胞的体外增殖。