目前,肿瘤的发病率和死亡率在中国乃至世界仍居高不下,它不仅给患者本人及其家庭带来巨大的痛苦,同时也对整个社会的发展与进步造成极大的威胁。因此,寻求安全、有效、低毒的抗肿瘤药物一直受到国内外医药界专家学者的重视,而从天然化合物中开发此类药物也成为研究热点。所有癌细胞的一个特异性表型异常是细胞周期调控失调,细胞周期的调控与多种细胞内信号通路有关,阻断细胞内信号通路从而抑制细胞周期正调控相关蛋白表达是抑制肿瘤细胞异常增殖的关键。本研究在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制,为阐明小檗碱阻滞肿瘤细胞周期进展、抑制肿瘤细胞增殖的作用机理提供实验依据,并为小檗碱抗肿瘤的临床应用提供理论依据。第一部分:研究小檗碱对人高转移性肺癌PG细胞周期进展和Cyclin D1表达的影响。1.培养人高转移性肺癌PG细胞,采用MTT法检测小檗碱对PG细胞增殖的作用。与对照组相比,经不同浓度(10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml)的小檗碱处理24小时和48小时,PG细胞生长明显受到抑制。2.流式细胞仪检测小檗碱对PG细胞周期进展的影响,结果表明,小檗碱可使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少,与对照组相比有显著差异(P <0.01);小檗碱高低剂量组间有明显差异(P <0.05)。3.RT-PCR结果显示,经不同浓度小檗碱处理后24小时,PG细胞Cyclin D1的mRNA水平较对照组明显降低。小檗碱对PG细胞Cyclin D1的表达有抑制作用。第二部分:研究小檗碱对PG细胞Cyclin D1相关信号通路的作用。在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制。1.双荧光素酶报告基因结果显示,小檗碱对PG细胞AP-1, Wnt信号通路活性有明显抑制作用,而对NF-κB信号通路影响不明显。进一步实验表明,经PDB+Ionomysin处理的PG细胞AP-1信号通路被激活,小檗碱能有效抑制这种激活,其作用呈剂量依赖性。2. Western Blot检测表明,经不同浓度小檗碱处理后,PG细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun蛋白含量明显降低,降低的水平与小檗碱浓度相关。3. EMSA结果显示,不同浓度的小檗碱均能抑制PG细胞核提取物与带有野生型AP-1位点的寡核苷酸结合;经小檗碱处理后PG细胞核提取物与Cyclin D1上游启动子区带有AP-1位点的寡核苷酸结合减少。实验结果提示:1.小檗碱通过抑制周期进展关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,从而抑制PG细胞增殖。2.小檗碱对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对NF-κB通路活性影响不明显。小檗碱对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显著的抑制作用。3.小檗碱能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达。这是小檗碱抑制Cyclin D1表达、进而阻滞肿瘤细胞周期的机制之一。