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脑卒中已成为导致患者致残、死亡的主要原因之一,其中缺血性脑卒中约占80%。脑血管闭塞后,除缺血区的血管增生,改善半暗带血流,恢复神经元生理功能,保护现有的微血管结构和功能的完整性之外,还迫切地需要具有治疗作用的新生血管对缺血区域的血流灌溉,从而挽救受损的脑组织,减缓疾病的发展进程。新生血管是决定缺血性脑卒中缺血半暗带和梗死体积的重要因素之一。研究表明,血管新生的过程受到多种基因、血管生长因子的参与,microRNA（miRNA）具有特异性基因调控能力,其中表达于血管内皮细胞的miRNA分子,通过调节内皮细胞生理功能,促进血管的生成和修复。miRNA-210为缺氧特异性miRNA,通过负调控靶基因ephrin A3,具有促进血管形成的能力。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）作为血管新生的核心调控因子对血管新生具有重要作用,主要通过上调血管内皮生长因子（VEGF）受体使血管通透性增加为血管形成作好准备。VEGF-Notch信号通路是缺血后血管新生的重要通路。VEGF系统和下游的Notch通路分别与各自受体相结合,诱导细胞的分裂、增殖,形成新生血管。中医学将缺血性脑卒中归属于“中风”、“卒中”,最早记载于《黄帝内经》,脑脉瘀阻、神机失用是缺血性脑卒中发病的重要因素。我们根据传统中医理论知识,结合历史文献和临床研究,认为缺血性脑卒中的基本病机为气血失和、脑络失养。并提出了以和血生络法为治疗原则而自拟的和血生络方治疗缺血性脑卒中,在临床治疗缺血性卒中取得了良好的疗效。因此,进一步对和血生络方促血管新生的机制的研究是本课题的重点,也为应用于临床奠定基础。本论文研究内容主要包括以下三个部分:第一部分:和血生络方对局灶性脑缺血大鼠梗死面积、miRNA-210、ephrin A3表达的影响目的:以大脑中动脉栓塞法制造脑缺血大鼠模型为研究对象,观察和血生络方对大鼠脑梗死面积、缺血皮质区脑组织中miRNA-210及其靶基因ephrin A3的表达的影响。方法:SD大鼠,雄性,体重250-280g,随机分为Sham group、Model group、HXSLF group、TXL group、AST group。Model group和各给药组采用大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）法建立局灶性脑缺血大鼠模型。Sham group不做缺血处理。参照Zea-Longa 5评分法进行神经功能评分,1-3分者纳入实验研究。各给药组于术后1d开始给药,共7d。Sham group和Model group给予等量生理盐水。TTC染色检测大鼠脑梗死面积;免疫荧光染色法检测脑缺血后缺血皮质区ephrin A3的表达水平;RT-q PCR法检测缺血后缺血皮质区miRNA-210的表达和ephrin A3的基因表达水平。结果:与Sham group相比,Model group出现大面积的脑梗死区域（P<0.01）;ephrin A3阳性细胞数表达降低（P<0.01）;miRNA-210的表达及ephrin A3 m RNA的表达均成上升趋势（P<0.01）。与Model group相比,HXSLF group、AST group、TXL group大鼠脑梗死面积明显减小（P<0.01）;miRNA-210的表达以及ephrin A3 m RNA的表达均显著升高（P<0.01）,且HXSLF group、TXL group ephrin A3阳性细胞数表达显著降低（P<0.01）。与TXL group相比,HXSLF group、AST group脑梗死面积减小更为明显（P<0.01）,miRNA-210的表达升高更为明显（P<0.01）;HXSLF group ephrin A3 m RNA的表达升高更为明显（P<0.01）,ephrin A3阳性细胞数表达下降更为明显（P<0.01）。结论:1.线栓法成功建立局灶性脑缺血大鼠模型。除假手术组外各大鼠脑组织出现不同面积的梗塞区域,神经功能评分符合有效模型。2.经过和血生络方治疗能够促进MCAO大鼠缺血皮质区miRNA-210的表达升高,并抑制靶基因ephrin A3的表达,缩小脑梗塞面积。第二部分:和血生络方对HUVECs增殖能力、成管能力、miRNA-210及ephrin A3表达的影响目的:在缺氧条件下,通过体外培养HUVECs观察细胞的增殖能力、血管形成能力以及miRNA-210、ephrin A3表达水平的变化,探讨和血生络方的促血管新生作用。方法:采用DMEM培养基、10%胎牛血清培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,于37℃、5%CO2培养箱常规培养。分为NC group、OGD group、HXSLF group、HXSLF inhibitor group;NC group、OGD group、AST group、TXL group。上述缺氧条件均为1%O2、94%N2、5%CO2。MTT法进行细胞活力测定;血管样结构形成能力检测;流式细胞术法检测细胞中ephrin A3的表达;RT-q PCR法检测细胞中miRNA-210的表达水平。结果:与NC group相比,OGD group细胞增殖能力显著降低（P<0.01）;血管形成结构能力降低,不能形成管腔样结构（P<0.01）;ephrin A3蛋白的表达降低（P<0.01）;miRNA-210的表达升高（P<0.01）。与OGD group相比,HXSLF group、AST group能够显著刺激细胞增殖、活力增强（P<0.01）;血管形成结构能力显著增强（P<0.01）;ephrin A3蛋白的表达显著降低（P<0.01）;miRNA-210的表达显著升高（P<0.01）。与HXSLF inhibitor group相比,HXSLF group细胞增殖能力、血管形成结构能力增强,有显著性差异（P<0.01）;ephrin A3蛋白的表达水平显著降低（P<0.01）;miRNA-210的表达升高（P<0.01）。与TXL group相比,AST group细胞增殖能力、血管形成结构能力略低（P<0.01）;ephrin A3蛋白表达降低（P<0.01）;miRNA-210表达升高,有显著性差异（P<0.01）。结论:1.体外缺氧培养HUVECs,模型组细胞出现增殖能力、血管形成能力降低。2.缺氧后细胞出现miRNA-210的表达稍显升高,靶基因ephrin A3的表达有所降低,但并不能满足缺氧后细胞自身的恢复需求。3.和血生络方能够明显增加HUVECs细胞缺氧后细胞活性,促进细胞增殖,血管形成能力增强,调节miRNA-210的表达,抑制ephrin A3的表达,发挥促血管新生作用。第三部分:和血生络方对HUVECs HIF-VEGF-Notch信号通路的影响目的:通过检测HUVECs HIF-VEGF-Notch信号通路相关分子HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1的表达,探讨和血生络方促血管新生的作用机制。方法:培养条件及分组同第二部分。采用Western blot法检测细胞中HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1蛋白的表达水平;RT-q PCR法检测细胞中HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1 m RNA的表达水平。结果:与NC group相比,OGD group HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1蛋白及m RNA的表达升高（P<0.01）。与OGD group相比,HXSLF group、AST group HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1蛋白及m RNA的表达显著升高（P<0.01）。与HXSLF inhibitor group相比,HXSLF group HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1蛋白及m RNA的表达升高（P<0.01）。与TXL group相比,AST group HIF-1α、VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1蛋白及m RNA的表达升高,有显著性差异（P<0.01）。结论:1.缺氧损伤后,miRNA-210及靶基因ephrin A3能够通过与下游VEGF因子结合,激活HIF-VEGF-Notch信号通路相关分子的表达,调节血管的生成。2.和血生络方能够通过调节miRNA-210的表达,参与调控HIF-VEGF-Notch信号通路分子水平的变化,发挥缺血性脑卒中促血管新生的作用。