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目的:胃癌是常见恶性肿瘤,研究表明幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)感染是胃癌发生的重要危险因素。Hp感染伴有血清胃蛋白酶原异常者胃癌发病率明显增高。研究认为,Hp可引起细胞双链DNA分子的损伤(DSBs),诱导染色体畸变,导致细胞死亡或肿瘤发生。CagA蛋白是Hp的重要致病因子,在胃癌发生中起着至关重要的作用。胃动蛋白基因家族(Gastrokines,GKNs)是胃组织特异的具有自稳、抑癌基因作用的蛋白质,可抑制胃癌发生。三叶草因子家族(trefoil factor family,TFF)主要来源于人体胃肠道组织粘液分泌细胞,可促进胃黏膜上皮细胞的移动,调节胃黏膜上皮细胞的分化,是胃粘膜保护因子。我们前期实验结果显示,Hp感染可导致胃黏膜保护因子TFF1、GKN2表达显著下降,与胃癌的发生密切相关。但Hp主要致病蛋白CagA诱导胃黏膜细胞DNA损伤修复的作用,以及TFF1/GKN2对DNA损伤修复的影响有待进一步探讨。方法:1.采用细胞培养方法,观察不同浓度CagA不同时间处理对胃黏膜永生化细胞(GES-1)双链DNA的损伤标志蛋白γH2AX表达的影响。2.采用Western Blot、Real-time PCR等分子生物学技术检测γH2AX、Ku70以及Ku80表达,分析TFF1/GKN2对Hp引起的DNA损伤修复的影响。结果:1.Cag A对GES-1细胞双链DNA损伤的影响采用2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml浓度的CagA蛋白处理GES-1细胞,Western blot结果显示各浓度组在24h、48h、72h和96h时GES-1细胞γH2AX的表达均明显高于对照组,提示Hp可引起细胞发生双链DNA分子的损伤。2.过表达TFF1和GKN2对Hp诱导的DNA损伤修复的影响前期研究表明,CagA可明显降低GKN2和TFF1的表达,在此工作的基础上,本研究通过过表达TFF1和GKN2方法,进一步探讨TFF1和GKN2对Hp诱导的DNA损伤修复的影响。2.1过表达GKN2在CagA诱导的DNA损伤及修复中的作用预转染GKN2质粒72h,给与CagA刺激24h,Western blot结果显示GKN2过表达CagA处理组γH2AX表达明显低于单纯CagA处理组(0.550±0.083 vs 0.722±0.094,P<0.05)。而过表达GKN2后CagA处理组GES-1细胞中Ku70,Ku80蛋白表达均比单纯CagA处理组表达增高(0.749±0.105 vs 0.558±0.088,0.343±0.057 vs 0.208±0.047,P<0.05)。2.2 TFF1慢病毒转染后CagA刺激对DNA损伤修复的影响Western blot结果显示TFF1过表达CagA处理组γH2AX表达明显低于单纯CagA处理组(0.752±0.064 vs 1.124±0.172,P<0.05)。而且,与CagA处理组相比,TFF1过表达CagA处理组Ku70蛋白表达明显升高(0.536±0.047 vs 0.288±0.033,P<0.05),而Ku80蛋白表达变化不明显。结论:1.Hp CagA蛋白可引起GES-1细胞发生双链DNA分子损伤。2.GKN2和TFF1可降低Hp CagA蛋白对GES-1细胞DNA损伤的影响,并提高其修复能力,对胃黏膜细胞具有保护作用。