论文部分内容阅读
目的：短串联重复序列（short tandom repeats, STR）是目前法医学亲子鉴定与个体识别的主流遗传标记。X染色体STR遗传标记因其独特的遗传方式和结构特征，在一些特殊的或者复杂的亲权鉴定案件中具有常染色体STR或Y染色体STR遗传标记所无可比拟的优势。但目前X-STR在法医学中的应用尚不成熟，仅有2010年推出的商品化试剂盒，即Qiagen公司生产的Investigator Argus X-12试剂盒，包括分布于X染色体4个连锁群中的12个X染色体STR基因座。然而，这些基因座在不同人群的基因频率分布存在差异，其中某些基因座在中国汉族人群的多态性程度不高，并且，该试剂盒的系统效能也有待进一步提高。因此，本研究拟筛选更多X-STR基因座，对中国北方汉族人群进行群体遗传学调查，筛选出在中国汉族人群中具有高度多态性的基因座，为研发X染色体STR分型试剂盒提供基础数据。方法：1基因座的筛选：登录NCBI网站和UCSC网站，根据筛选条件，选出符合条件的X-STR基因座作为研究对象。筛选条件：无相关法医学报道；重复单位为四核苷酸的基因座；基因座扩增产物片段分布在100-400bp之间；不同基因座引物之间特别是3’端不出现互补序列；扩增条件相近。据此，本研究选出17个X-STR基因座作为研究对象，采用PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法，对该17个X-STR基因座在中国河北汉族群体（40个无关健康个体）的遗传多态性进行初步调查，选出其中多态性较好的7个基因座，进行详细研究。2复合分型体系的构建：对筛选出的7个多态性较好的X-STR基因座，应用荧光STR分型技术构建两个复合扩增体系，对扩增体系中的引物浓度、Mg2+浓度、退火温度及循环次数进行优化。采用AB3130基因分析仪对PCR产物进行检测；使用Genemapper3.2软件分析结果；根据国际法医遗传学会（international society of forensic genetics, ISFG）推荐的命名原则对各等位基因进行命名。对每个等位基因进行测序验证，分析重复序列的结构。3群体遗传学调查：应用上述两个复合分型体系对中国北方汉族群体364名健康无关个体（男性200名、女性164名）进行群体遗传学调查，获得7个X-STR基因座的等位基因分布频率，应用χ2拟合优度检验对各基因座进行Hardy-Weinberg平衡检验，使用Arlequin software version3.1软件对各基因座等位基因频率、连锁不平衡分析进行计算。4法医学应用评估：对上述7个X-STR基因座荧光分型体系进行种属特异性及可重复性研究，并评估其在亲缘关系鉴定中的应用价值。结果:1复合分型体系的构建：对初筛的7各基因座DXS1268、GATA83F09、GGAT4B02、GATA42D03、GATA22E12、GATA130D02、DXS2498的引物进行荧光标记。其中基因座DXS1268、GATA83F09、GGAT4B02、GATA42D03、 GATA22E12上游引物5’端标记FAM荧光，基因座GATA130D02、DXS2498上游引物5’端标记HEX荧光。以此构建2个复合扩增体系，体系1中包括基因座DXS1268、GGAT4B02、GATA42D03、GATA22E12，体系2中包括基因座GATA83F09、GATA130D02、DXS2498。两个扩增体系经优化反应条件后，得到的等位基因峰图峰型尖锐、对称。2群体遗传学调查结果：对164例北方汉族无关健康女性个体的调查结果显示，DXS1268基因座检测到5个等位基因和11种基因型；GATA42D03基因座检测到6个等位基因和10种基因型；GATA22E12基因座检测到4个等位基因和10种基因型；GATA83F09基因座检测到8个等位基因和20种基因型；GGAT4B02基因座检测到4个等位基因和9种基因型；GATA133D02基因座检测到5个等位基因和12种基因型；DXS2498基因座检测到4个等位基因和6种基因型。对200例男性无关个体的调查结果显示，DXS1268基因座检测到6个等位基因；GATA42D03基因座检测到6个等位基因；GATA22E12基因座检测到4个等位基因；GATA83F09基因座检测到6个等位基因；GGAT4B02基因座检测到5个等位基因；GATA133D02基因座检测到5个等位基因；DXS2498基因座检测到3个等位基因。χ2拟合优度检验的结果显示，除基因座DXS2498外（P<0.05），其余6个基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），因此，本实验对基因座DXS2498的研究不再涉及。χ2检验结果显示各基因座在男性与女性样本中等位基因频率分布均无显著差异（P>0.05），故将男性与女性样本的频率合并后计算遗传学参数，DXS1268、GATA42D03、GATA22E12、GATA83F09、GGAT4B02、GATA130D02的杂合度观察值（Ho）依次为：0.6118、0.4809、0.6221、0.7129、0.3160、0.6044；多态信息含量（PIC）依次为：0.5362、0.4422、0.5610、0.6654、0.2940、0.5377；女性个体识别率（PDfemale）依次为：0.7737、0.6918、0.7961、0.8701、0.5101、0.7769；男性个体识别率（PDmale）依次为：0.6118、0.4809、0.6221、0.7129、0.3160、0.6044；三联体平均排除概率（MECKishida）依次为：0.5362、0.4421、0.5610、0.6654、0.2904、0.5365；二联体平均排除概率（MECDesmarais Duo）依次为：0.3922、0.2295、0.4141、0.5237、0.1792、0.3929。根据上述结果，以PIC>0.5为标准，筛选出4个具有高度多态性的基因座：DXS1268、GATA22E12、GATA83F09、GATA130D02。3法医学应用评估：上述构建的两个复合分型体系，7个基因座在猪、鼠、羊、牛、兔等常见动物中均未发现特异性分型，具有较好的种属特异性；应用10例明确父女关系的案例进行验证评估，女儿均可稳定地获得父亲X染色体的等位基因，表明该7个基因座具有较好的遗传稳定性。结论：本研究获得了7个X-STR基因座的群体遗传学参数，从中优选出4个具有高度多态性的基因座DXS1268、GATA22E12、GATA83F09、GATA130D02，为研发X-STR试剂盒提供了基础数据。