研究背景与目的心肌梗死是威胁人类健康的主要疾病之一,ST段抬高型心肌梗死是急性心肌梗死病的常见类型,具有较高的死亡率和致残率,严重威胁人类健康,给患者家庭带来沉重的经济负担和生活压力。急性心肌梗死是心外膜冠状动脉闭塞导所致,其结果是闭塞远端的心肌组织缺血,若不能及时恢复冠状动脉供血,缺血的心肌将永久性坏死。溶栓治疗和经皮冠状动脉介入治疗等早期再灌注治疗是最为有效和广泛使用的治疗手段。对于没有机会接受再灌注治疗的患者来说,通过药物干预、基因治疗、干细胞移植等手段改善心肌梗死后心室重构是一种合理的治疗策略。内质网是参与膜蛋白和分泌蛋白折叠过程的重要细胞器。多种细胞应激,如缺血、缺氧、热休克、基因突变、氧化应激等均可导致蛋白质合成增加,导致内质网功能受损,这些损伤内质网功能的刺激统称内质网应激(ERS)。ERS过度或者被延长时,内质网通过多条信号通路激活凋亡信号,包括诱导C/EBP同源蛋白(CHOP)合成,激活JNK和裂解caspase-12。急性心肌梗死时冠状动脉闭塞导致罪犯血管管辖区域心肌细胞急性缺血,风险区(AAR)心肌细胞缺血持续时间到达20分钟及以上时,心内膜心肌细胞开始死亡,而且随缺血时间推延逐渐扩展到心外膜形成透壁性心肌梗死。组织缺氧和营养供应不足将导致心肌细胞一系列生化改变和代谢改变。缺氧的心肌细胞氧化磷酸化受损,导致线粒体膜去极化,ATP缺失并抑制心肌细胞收缩功能。为了维持线粒体膜电位的功能,F1FOATP酶活性增加,线粒体内磷酸化增强,使残留ATP逐渐分解利用,ATP减少会加重缺氧导致的心肌细胞收缩功能损害。缺氧将导致心肌细胞氧化磷酸化中断,无氧糖酵解启动,乳酸堆积, 使细胞内PH下降至7.0以下。细胞无氧代谢产物堆积将激活Na+-H+离子交换体,促使细胞内Na+超负荷。作为对Na+超负荷的代偿反应,Na+-Ca2+离子交换体激活,钙离子内流,导致心肌细胞钙超载(钙离子超负荷),进而激活内质网应激。心肌细胞凋亡和心肌纤维化是导致心室重构和心功能不全的重要原因。心肌梗死时,破坏的心肌组织为纤维瘢痕组织取代。由于纤维瘢痕组织没有舒缩能力,左心室舒缩功能受损,最终进展为慢性心力衰竭。而另一方面,心肌缺血导致心肌细胞凋亡,左心室收缩功能受损,如果心肌缺血持续得不到纠正,最终导致慢性心力衰竭。心肌细胞凋亡和心肌纤维化将促进左心室重构,左心室的病理表现是左心室梗死区域变薄,心室内腔扩大和收缩舒张功能受损。而心室重构与血流动力学状态异常密切相关,长期得不到纠正将导致慢性心力衰竭。大量研究表明ERS与心肌细胞凋亡和心肌纤维化有密切关系。当心脏遭受压力负荷、缺血／再灌注损伤或心肌梗死时,ERS加重,CHOP表达上调,进而导致心肌细胞凋亡、心室重构、心肌纤维化和心功能不全。大量研究表明通过药物干预或遗传学手段敲除(或敲低)CHOP可减轻内质网应激,抑制心肌细胞凋亡和炎症反应,改善压力负荷小鼠心室重构和减轻小鼠心脏缺血／再灌注损伤。然而,敲除CHOP在永久心肌梗死中的作用尚不明确。上述研究分析提示敲除CHOP可能在心肌梗死后心室重构中发挥重要作用。本课题旨在验证敲除CHOP在心肌梗死后心室重构中的作用及其机制,为临床上没有条件或者错过接受再灌注治疗的心肌梗死患者提供新的治疗手段。研究方法1.心肌梗死模型的建立8-12周龄,体重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0丝线穿过左心耳下缘1-2mm处的2/3心肌层,永久结扎左侧冠状动脉。手术过程中一直进行心电监护,以心电图ST段抬高和心肌变白为判断心肌梗死成功的标准,心肌梗死成功后关闭胸腔,使心肌永久缺血28天。假手术的制作过程相似但无需结扎冠状动脉。2.心肌缺血/再灌注模型建立8-12周龄,体重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0丝线带针线穿过左心耳下缘1-2mm处的2/3心肌层,针尾套入珠子后短暂结扎左侧冠状动脉诱导心肌缺血45分钟后解除结扎使其再灌注7天。手术过程中一直进行心电监护,心电图ST段视作缺血成功的标志,去除珠子后ST段下降视作再灌注成功标志。假手术仅需套入珠子而无需结扎冠状动脉。3.生存分析用8-12周龄,体重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠制作心肌梗死模型,实验分为4组：野生型+假手术组、野生型+心肌梗死组、基因敲除+假手术组以及基因敲除+心肌梗死组。观察和记录4周内小鼠的生存率和死亡原因。4.心肌梗死面积测量为评价敲除CHOP对心肌梗死小鼠心肌梗死程度的影响,我们于心肌梗死术后3-12小时内戊巴比妥钠过量麻醉脱臼处死小鼠,心脏取材,-20℃冰冻后切片做TTC染色测量心肌梗死面积。实验分为野生型+心肌梗死组、基因敲出+心肌梗死组。被红染的部分为正常组织,白色部分为坏死组织,心肌梗死面积(%)=梗死区域面积／左心室面积×100%。5.超声心动图检查小鼠心梗模型制备4周后用心脏超声仪测量左室内径和功能,分为野生型+假手术组、野生型+心肌梗死组、基因敲除+假手术组、基因敲除+心肌梗死组。清醒状态下固定小鼠,左侧胸部脱毛后,二维超声定位,M超测量舒张期左室前后壁厚度(LVAWd和LVPWd),左室舒张末内径(LVEDd)和左室收缩末内径(LVESd),进而测量左室缩短分数(LVFS)和左室射血分数(LVEF):LVFS (%)=(LVEDd—LVESd)/LVEDd×100%,LVEF (％)=[(LVEDV-LVSv)/ LVEDc]×100%.超声检查后,将小鼠以0.5%戊巴比妥钠过量(100mg/kg)麻醉颈椎脱臼处死,称量心脏重量和肺重量以计算心重体重比和肺重体重比。6.创伤性左室血流动力学检查小鼠心梗模型制备4周后检测小鼠左室血流动力学指标,实验分为野生型+假手术组、野生型+心肌梗死组、基因敲除+假手术组、基因敲除+心肌梗死组。甲苯噻嗪和氯胺酮复合麻醉,气管插管,机械通气。显微镜下右侧颈总动脉置入米勒导管(Millar导管),轻轻送入左心室,测量心率(HR),左室收缩压(LVSP),左室舒张末压(LVEDP),并通过PowerLab软件程序计算左室压力最大、最小变化率(dp/dt max,dp/dt min)和指数的弛豫时间常数(τ)。7.TUNEL染色和Masson染色我们通过TUNEL染色和Masson染色评价敲除CHOP对心肌细胞凋亡和心肌纤维化的影响,实验分为野生型+心肌梗死组、基因敲出+心肌梗死组、野生型+缺血／再灌注组、基因敲出+缺血／再灌注组。其中小鼠心肌梗死4周,缺血／再灌注7天过量麻醉脱臼处死取材,4%多聚甲醛固定固定后石蜡包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色。8.统计学分析SPSS16.0测量统计显著性差异,计量数据用均数±标准误(mean±SE)表示。三组以上的统计学差异用ANOVA检验,组间差异用Bonferroni氏法校正。整体生存状况用Kaplan-Meier生存分析,组间比较用对数秩检验。P<0.05代表具有统计学意义。结果1.敲除CHOP增加小鼠心肌梗死死亡率选取经过基因鉴定的8-10周龄,雄性,体重约20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后每天观察2次,早晚各1次,及时发现死亡小鼠并行尸检确定死亡原因,详细记录和统计分析小鼠的生存情况和死亡原因。心肌梗死4周CHOP基因敲除小鼠心梗死亡率显著高于野生型小鼠(68% vs 38.5%,P<0.05),说明敲除CHOP增加小鼠永久性心肌梗死死亡率。2.敲除CHOP对小鼠心肌梗死面积没有影响敲除CHOP会增加小鼠心肌梗死死亡率,那么敲除CHOP对心肌梗死程度的影响如何呢?我们选取经过基因鉴定的8-10周龄,雄性,体重约20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后3-12小时内0.5%戊巴比妥钠过量麻醉脱臼处死小鼠,摘取心脏-20℃冷冻后切片行TTC染色测量心肌梗死面积。研究发现敲除CHOP基因敲除小鼠与其野生型小鼠的心肌梗死面积相似(45.7% vs 47.3%,P=0.54),说明敲除CHOP不能减小小鼠心肌梗死面积。3.敲除CHOP对小鼠心肌梗死心室重构和心功能没有影响既然敲除CHOP对小鼠心梗面积没有影响,那么敲除CHOP对心肌梗死后心室重构和心功能有什么影响呢?我们选取心肌梗死后4周的小鼠进行超声心动图检查评价心室重构程度和心功能。处死小鼠称取心肺重量评价永久性心肌梗死对心肺形态的影响。结果表明心肌梗死4周,CHOP敲除基因鼠与野生型小鼠相比较,除了左室前壁厚度(LVAWd)显著增厚之外,左室后壁厚度(LVPWd)、左心室舒张末直径(LVEDd)和左室收缩末内径(LVEDs)二组之间没有统计学差异。左心室收缩功能方面,左室缩短分数(LVFS)和左室射血分数(LVEF)两组间也没有统计学差异。而与接受假手术的小鼠相比,CHOP敲除基因鼠和野生型小鼠有相似的改变：左心室显著扩大(LVESd和LVEDd增加),LVFS和LVEF显著下降。而另一方面,无论CHOP敲除组还是野生型组小鼠心肌梗死对心肺重量没有显著影响。这些结果说明敲除CHOP不能改善心肌梗死后心室重构和心功能。4.敲除CHOP对小鼠心肌梗死左心室血流动力学没有影响超声水平验证敲除CHOP对心肌梗死心室重构和心功能的影响后我们接着验证敲除CHOP对小鼠心肌梗死血流动力学的影响。同样,我们选取心梗模型后4周小鼠行有创血流动力学检查。置入millar导管后连接Powlaber系统测量血流动力学指标。结果表明与接受假手术的小鼠相比,接受心肌梗死手术4周的小鼠,无论左室收缩压(LVSP)、左室压力最大、最小变化率(dp/dt max, dp/dt min)、左室收缩力(contractility)以及左室舒张末压力(LVEDP)指数弛豫时间常数(τ)显著下降,然而CHOP基因敲除组与野生型组之间并没有统计学差异。这些结果表明敲除CHOP不能改善心肌梗死后左心室血流动力学状态。5.敲除CHOP对小鼠心肌梗死心肌细胞凋亡水平和心肌纤维化程度没有影响上述结果表明敲除CHOP对小鼠心肌梗死后心脏形态学和功能学都没有影响,接下来我们在组织学水平验证CHOP对小鼠心肌梗死的影响。小鼠心肌梗死4周心脏取材固定、石蜡包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色检测心肌细胞凋亡和心肌纤维化。结果显示心肌梗死4周,CHOP敲除小鼠和野生型小鼠的心肌梗死区被纤维瘢痕组织取代,两组的陈旧心梗面积(纤维化)和交界区心肌纤维化程度没有显著差异,CHOP敲除小鼠心肌细胞凋亡较野生型小鼠无显著差异。6.敲除CHOP对小鼠心肌缺血/再灌注心肌梗死面积、心肌细胞凋亡和心肌纤维化的影响上述研究表明敲除CHOP增加永久性心肌梗死的死亡率,不能减轻心室重构和心功能损害,而大量文献报道敲除或下调CHOP表达对小鼠心肌缺血／再灌注损伤有利。有鉴于此,我们进一步研究了敲除CHOP对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。心肌缺血45分钟,再灌注24小时处死小鼠做心脏TTC染色测量心肌梗死面积；心肌缺血45分钟,再灌注7天处死小鼠心脏组织切片做TUNEL染色和Masson染色。我们发现CHOP敲除组(KO)心梗面积较野生型小鼠(WT)显著减小,有统计学差异(29.83% VS 17.34%,P<0.05)；敲除CHOP也能显著减轻小鼠缺血／再灌注损伤心肌纤维化(23.0% VS 16.0%,P<0.05)和心肌细胞凋亡(0.84% VS 0.56%,P<0.05),有统计学差异。这些结果说明敲除CHOP能减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤。结论尽管抑制CHOP有抗心肌细胞凋亡和抗心肌纤维化的作用,然而敲除CHOP一方面增加永久性心肌梗死心脏破裂发生率且不能改善心肌梗死后心室重构,另一方面可以减轻心肌再灌注损伤。说明再灌注治疗是敲除CHOP使心肌梗死获益的先决条件。