【摘 要】
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肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）,为TGF-β超家族主要成员之一,又名生长分化因子8（GDF8）。由于MSTN基因为一种在肌肉生长与发育中的负调节因子,敲低或敲除MSTN基因对于选择双肌表型的畜禽新品种有着巨大的经济价值。尽管GFP已经作为优秀的蛋白标签,但存在标签过大、其永久荧光会干扰其他标签的检测、光漂白等问题。GFP11标签则具有片段小的优点,可以与目的蛋白进行串联、融合表达。
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肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）,为TGF-β超家族主要成员之一,又名生长分化因子8（GDF8）。由于MSTN基因为一种在肌肉生长与发育中的负调节因子,敲低或敲除MSTN基因对于选择双肌表型的畜禽新品种有着巨大的经济价值。尽管GFP已经作为优秀的蛋白标签,但存在标签过大、其永久荧光会干扰其他标签的检测、光漂白等问题。GFP11标签则具有片段小的优点,可以与目的蛋白进行串联、融合表达。与GFP1-10互补后,产生GFP荧光,这种基于双分子荧光互补技术的Split-GFP依然可以作为一种可视化检测标记,降低了GFP大标签对其标记蛋白和细胞的影响。本试验的目的是,用GFP11标记MSTN,构建稳定表达GFP11-MSTN的HEK 293T细胞,经RNA干涉,再转染GFP1-10表达质粒,以可视化方式评估MSTN沉默效果,并与q RT-PCR和Western blotting检测结果相比对,验证Split-GFP的可行性。1、稳定表达GFP11-MSTN的细胞株筛选构建p LVX-GFP11-MSTN慢病毒表达载体与pc DNA3.1（+）-GFP1-10表达载体,通过共转染HEK293T细胞初步验证Split-GFP系统的可行性;包装p LVX-GFP11-MSTN慢病毒载体,通过感染HEK 293T细胞和嘌呤霉素筛选,获得稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的293TGFP11-MSTN细胞株,并通过q RT-PCR、Western Blotting和Split-GFP系统验证GFP11-MSTN表达。结果显示:（1）DNA测序标明,p LVX-GFP11-MSTN与pc DNA3.1（+）-GFP1-10构建成功;单独转染p LVX-GFP11-MSTN或pc DNA3.1（+）-GFP1-10,细胞不产生荧光,两者共转染可以产生绿色荧光,初步验证了Split-GFP的有效性。（2）q RT-PCR和Western Blotting证实获得了稳定表达GFP11-MSTN的293TGFP11-MSTN细胞株,Split-GFP系统可以反映MSTN的表达水平。2、RNAi介导的鸡MSTN沉默针对MSTN基因3个不同靶点,构建3个sh RNA慢病毒载体,通过q RT-PCR和Split-GFP系统,筛选沉默效果最好的sh RNA慢病毒载体进行病毒包装、滴度测定和感染HEK 293T细胞,筛选最适MOI;sh RNA慢病毒感染293TGFP11-MSTN细胞株,经潮霉素B筛选和扩大培养后,瞬时转染pc DNA3.1（+）-GFP1-10载体,利用q RT-PCR、Western Blotting和Split-GFP系统检测RNA干涉效果。结果显示:（1）3个sh RNA对MSTN都存在显著沉默作用,其中,针对MSTN基因1号外显子的sh RNA-a效果最佳;（2）成功包装sh RNA-a慢病毒载体,滴度达2.85×10~8TU/m L,该病毒对293TGFP11-MSTN细胞的最佳MOI=3,最佳潮霉素B筛选浓度为250μg/m L。（3）sh RNA-a慢病毒载体感染293TGFP11-MSTN细胞株,荧光显微镜观察和流式细胞术显示,与阴性对照组相比,RNA干涉组GFP+细胞百分率显著下降,q RT-PCR和Wetstern Blotting检测也得到了相似的结果,进一步证实了Split-GFP系统的可行性。总而言之,本研究获得了稳定表达GFP11-MSTN的细胞株,并通过RNA干涉验证了Split-GFP系统的可行性。本研究为MSTN基因的功能研究提供了理想的试验材料;为鸡胚胎注射sh RNA慢病毒,体内实施MSTN基因沉默,从而获得双肌表型的肉鸡新品种奠定了基础。
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