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近年来非发酵菌在临床分离的致病菌中呈增加趋势,其中最主要菌种为不动杆菌和铜绿假单胞菌,不动杆菌中又以鲍曼不动杆菌最为常见。不动杆菌为条件致病菌,广泛分布于水、土壤、医院环境和人体的皮肤表面。目前,鲍曼不动杆菌已成为继大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌之后的重要临床分离菌。近几年来,多重耐药鲍曼不动杆菌已经在全球各地出现播散,甚至造成了爆发流行,并且伴随着耐药性的不断上升。世界各地相继报道了多重耐药鲍曼不动杆菌的流行:欧洲、北美、阿根廷、巴西、中国大陆、中国台湾、中国香港、日本、韩国,甚至偏远的西太平洋大西地岛等。碳青霉烯类抗生素对不动杆菌有较好的抗菌活性,是治疗不动杆菌重症感染的首选抗生素。近年来,有关碳青霉烯类抗生素耐药不动杆菌已经开始出现和流行。INSPEAR(the International Network for the Study and Prevention of EmergingAntimicrobial Resistance)将不动杆菌中出现碳青霉烯类抗生素耐药株称之为全球性的标志性事件,呼吁进行正确的流行病学和微生物学干预。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶。包括Ambler分子分类的A、B、D类酶。不动杆菌属中最主要的碳青霉烯酶是D类酶。D类酶目前报道按照氨基酸同源性可分为8组,在鲍曼不动杆菌中报道的主要4组是OXA-23组、OXA-24组、OXA-51组、OXA-58组。D类碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗生素的水解活性较低,对其耐药性的介导常合并外膜通透性的降低和/或外排泵的激活。而且,最近发现oxa-23-like和oxa-51-like基因上游存在插入序列ISAbal,而oxa-58基因与插入序列ISAba2、ISAba3相关。插入序列ISAba可能与OXA类碳青霉烯酶编码基因的同源重组、基因转移以及表达调控关系密切。近年来,一类特殊的16S rRNA甲基化酶被发现——它能保护细菌的16SrRNA也即氨基糖苷类抗生素的主要作用靶位,引起广谱的氨基糖苷类抗生素耐药,并且可在人和动物的致病菌间传播。armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA是从临床感染株中发现的6种主要的16S rRNA甲基化酶基因,最近欧洲和日本学者先后在一系列临床致病菌中发现该类基因,并且发现它们常位于可转移的质粒上,可在体外接合到受体菌。本研究收集了我国6个省市25家医院的700株鲍曼不动杆菌,筛选到342株碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌,对这些菌株的同源性、碳青霉烯酶基因型及其与插入序列ISAbal的关系、16Sr RNA甲基化酶基因的分布情况等进行了系统深入的研究。1.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌的筛选及耐药性研究使用K-B法(纸片扩散法)从700株鲍曼不动杆菌中筛选到了342株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌。利用琼脂稀释法和Etest法测定342株CRAB对14种常用抗菌药物的体外最低抑菌浓度。发现所有亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对美罗培南耐药,其中多粘菌素E耐药率最低为10.8%,头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦耐药率分别为54.2%和68.0%,米诺环素耐药率75.9%,其余抗菌药物耐药率均大于90.0%。2.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌同源性研究利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对342株CRAB进行了同源性研究。342株鲍曼不动杆菌菌株根据脉冲场凝胶电泳条带分析发现其中303株属于6个主要流行克隆株。其中A克隆共62株,分布在浙江、北京、重庆3个省市,并且在浙江播及7个城市的8家医院;B克隆32株,分布于杭州、上海、沈阳的3家医院;C克隆有160株,分布于浙江和上海,播散到了浙江8个城市的12家医院;D克隆有31株菌株,分布于浙江杭州和金华的3家医院;属于克隆E的10株菌株在广州中山医科大学附属第一医院流行;属于克隆F的8株菌株在金华中心医院流行。CRAB在我国呈严重的大范围流行态势,已经出现医院内的爆发流行、医院间甚至城市间的播散。需要采取切实有效的措施及时进行干预。3.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型及其与插入序列ISAbal关系研究利用超声破碎法提取β-内酰胺酶粗提物,三维实验、等电点测定、双纸片协同实验,检测CRAB所产碳青霉烯酶;利用PCR检测碳青霉烯酶基因、序列分析明确碳青霉烯酶基因型;利用重叠PCR研究oxa基因与插入序列ISAbal的关系;接合实验、质粒抽提、电转化、Southern杂交等明确碳青霉烯酶基因定位。342株碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌全部携带oxa-66基因,其中13株的oxa-66基因上游7bp处检测到插入序列ISAbal。322株CRAB菌株携带oxa-23基因,其中314株菌株oxa-23基因上游34bp处检测到插入序列ISAbal。ISAbal-oxa-23、ISAbal-oxa-66已在Genbank登录,登录号分别为:DQ923478、DQ923479。342株菌株中未检测到金属酶(IMP、VIM、SIM-1)基因,未检测到oxa-24组和oxa-58组D类碳青霉烯酶基因。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性不能通过接合、转化实验转移到受体大肠埃希菌,质粒抽提也未成功。Southern杂交提示oxa-23基因极可能位于菌株染色体上。研究证明,我国CRAB最主要的碳青霉烯酶基因型是oxa-23、oxa-66;插入序列ISAbal与oxa基因关系密切,在介导我国鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药中起重要作用。4.碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因分布研究琼脂稀释法测定342株CRAB对5种氨基糖苷类抗生素的MIC值,PCR筛选6种16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA,克隆测序明确基因型;接合试验、质粒抽提、转化实验,以及Southern杂交确定armA基因定位。342株碳青霉烯类抗生素对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星5种氨基糖苷类抗生素全部耐药菌株287株,其中221株检出armA基因;未发现rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA基因阳性菌株。armA基因阳性菌株PFGE分型以A、B、C 3型为主。碱裂解法反复抽提未得到质粒,多次接合、转化试验未成功;Southern杂交显示armA基因分别位于克隆A、B、C菌株染色体ApaI酶切脉冲场凝胶电泳约220kb、300kb、220kb大小的DNA片断上。16S rRNA甲基化酶基因armA在我国CRAB中广泛存在,armA阳性菌株以克隆播散形式广泛流行。armA基因定位于鲍曼不动杆菌的染色体上。以上研究表明:1、我国CRAB对各类抗菌药物耐药率高,多粘菌素E耐药率最低为10.8%,头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦耐药率分别为54.2%和68.0%。临床可以根据药敏结果选用含舒巴坦制剂,必要时可在严密监测肾功能的情况下考虑多粘菌素E治疗;2、CRAB在我国呈大范围流行态势,CRAB主要以克隆播散传播,已经出现医院内的爆发流行、医院间甚至城市间的播散。需要采取切实有效的措施及时进行干预。3、我国CRAB最主要的碳青霉烯酶基因型是oxa-23、oxa-66;插入序列ISAbal与oxa基因关系密切,在介导我国鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药中起重要作用。4、16S rRNA甲基化酶基因armA在我国CRAB中广泛存在,armA阳性菌株以克隆播散形式广泛流行。