阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是一种常见的与年龄相关的痴呆症,不仅起病隐匿,病情迁延渐进,且痴呆症状严重干扰患者日常生活。阿尔茨海默病的发病机制复杂,包括蛋白质错误折叠/聚集、β淀粉样蛋白聚集(amyloid-β)、线粒体功能障碍、兴奋性中毒、钙处理功能障碍、神经胶质细胞功能障碍、神经炎症和氧化应激。其中炎症和氧化应激是AD发病机制的中心环节。AD的确切发病机制和病因学需要进一步阐明,特别是对不同认知域损害的各种病理变化。作为对氧化应激的反应,细胞有不同的防御系统。调节氧化应激源性损伤,第二阶段的抗氧化反应被认为是目前最重要的防御途径。这个防御途径是由核因子E2相关因子2(Nrf2)调控的。Nrf2是一个参与多种蛋白表达的核转录因子,被认为是抵抗内界和外界氧化应激的关键转录因子。在生理条件下,Nrf2与KEAP1结合位于细胞质,Nrf2被控在低的蛋白水平。在氧化应激条件下,当Nrf2被激活与KEAP1解离,转位进入细胞核,与抗氧化反应元件(ARE)结合形成Nrf2-ARE信号通路。Nrf2/ARE激活后诱导和表达EpRE调控的基因,Nrf2的靶基因包括了调整谷胱甘肽(GSH)、抗氧化蛋白/酶、药物代谢酶或药物的调控的转运体、蛋白酶体亚单位、戊糖磷酸途径酶和参与核苷酸合成的酶。如血红素氧合酶1(heme oxygenase-1 HO-1)、谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase GST),辅酶Q10(Q10),NADPH,醌氧化还原酶和超氧化物歧化酶1(quinone oxidoreductase-1 NQO1),硫氧嘧啶(Thioredoxins Trxs),超氧化物SOD1(superoxide dismutase-1 SOD1),谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase GPx)和其他II和III相酶,可以防御氧化应激和外源性有毒物质,使细胞处于稳定状态,维持细胞氧化还原稳态。因此,核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路在细胞氧化应激损伤自我防御中发挥重要作用。Nrf2也介导抗炎和促炎因子的调整,在自身免疫中发挥作用。Nrf2还能通过p62/SQSTM1增强细胞自噬。最近,Nrf2的新功能被发现影响线粒体膜电位的调控和呼吸链ATP合成底物上。所以,Nrf2被认为是一个关键的调节因子,连接了炎症,自噬,线粒体功能与氧化应激,成为神经保护研究的有潜力的治疗靶点。快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse prone8,SAMP8)是一种以快速老化(accelated aging)自然出现学习记忆功能障碍呈为主要特征的老化模型。4-8月龄SAMP8小鼠是其随老化出现学习和记忆能力逐渐下降的重要时期,记忆和认知能力损害严重伴随增加的氧化应激,在脑组织里出现活化的小胶质细胞,特别是海马。SAMP8小鼠表现出老化过程中认知功能损害与神经病理学变化一致的趋势,是研究阿尔茨海默病的理想模型。与此对照的SAMR1鼠,是老化抵抗的老鼠,没有上述的病理特征。Nrf2,因其在抗氧化应激和神经炎症,调控自噬,维持细胞解毒功能,改善线粒体功能等多靶点的神经保护作用,覆盖了阿尔茨海默病理生理学机制的疾病网络,成为在神经退行性疾病治疗领域有发展前景的药物。然而纵观Nrf2的研究,目前主要集中在Nrf2/ARE通路下游相关产物的作用和影响,缺乏对AD认知功能直接影响的研究。Nrf2是否是影响AD认知功能的关键因素尚不明确。对Nrf2与AD之间的详细关系及其作用机制还需要更深的详尽的探索。本课题采用SAMP8小鼠和SAMR1小鼠作为研究对象,采用了慢病毒介导的RNA干扰技术,通过海马体立体定向注射Nrf2-ShRNA,靶向性的下调目的基因Nrf2在海马体内的表达。以SAMP8小鼠9月龄这一认知功能损害出现的早期阶段为观察时间的节点,明确下调Nrf2后,对9月龄快速老化小鼠和老化抵抗小鼠的学习记忆能力,突触结构可塑性,神经超微结构及炎症因子的影响,并探索其相应的神经生物学作用机制。第一部分下调海马内Nrf2对SAMP8小鼠认知功能的影响目的:通过三个连续的行为学实验,观察下调Nrf2基因表达对9月龄SAMR1和SAMP8小鼠的空间学习能力,情景记忆及情绪等不同认知域的影响,明确Nrf2敲减对SAMP8小鼠的认知功能的影响。方法:1.慢病毒Nrf2-ShRNA的构建。慢病毒购买自上海吉凯公司。经过Nrf2-ShRNA引物设计,构建载体,质粒载体酶切,病毒包装,构建Nrf2-Sh RNA。Q-PCR检测海马Nrf2-ShRNA在海马CA1区的表达效率。2.采用4月龄雄性SAMR1及SAMP8小鼠,分别接受阴性病毒(GFP)和Nrf2 ShRNA在海马区注射,使目的基因Nrf2在注射区域维持长时间的低表达。阴性病毒GFP,不携带目的基因,病毒滴度及包装与阳性病毒完全相同,仅表达绿色荧光。阳性病毒Nrf2 ShRNA,携带干扰Nrf2基因的质粒载体,同样表达绿色荧光。动物随机分为四组:1)R1+GFP(SAMR1小鼠接受带绿色荧光(GFP)的阴性对照病毒注射);2)R1+Nrf2 ShRNA(SAMR1小鼠接受下调Nrf2的阳性病毒注射);3)P8+GFP(SAMP8接受带绿色荧光(GFP)的阴性对照病毒注射);4)P8+Nrf2 Sh RNA(SAMP8小鼠接受下调Nrf2阳性病毒注射)3.注射5个月后,对9月龄的SAMP8和SAMR1小鼠开始连续的行为学实验观察各组小鼠的认知功能。行为学实验顺序为,新异物体识别实验,Morris水迷宫实验,避暗实验。4.行为学实验后,用免疫组织荧光染色方法,验证目的基因Nrf2在海马表达的稳定性。荧光显微镜及共聚焦显微镜下观察微管结合蛋白2(MAP2)和目的基因Nrf2在海马区的表达。结果:1.新异物体识别实验结果显示,9个月的SAMP8小鼠与同年龄SAMR1小鼠相比显示了更差的辨别新物体的能力(P<0.05),这提示在SAMP8小鼠9个月时出现了情景记忆的受损。在9月龄的两组SAMP8组小鼠中,在1小时的时间测试各组小鼠对两个物体的认知指数比较没有明显的差异(0.32±0.12 vs 0.41±0.14 P>0.05)。然而,在24小时的时间测试里,P8+Nrf2 ShRNA组认知指数下降。(P8+Nrf2 shRNA group vs P8+GFP group:0.36±0.15 vs 0.53±0.24)。在1小时和24小时测试结果显示,SAMR1+Nrf2 ShRNA小鼠与SAMR1+GFP组小鼠的认知指数无明显差异(P>0.05)。2.Morris水迷宫测试结果与R1组小鼠相比,同年龄的P8组小鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。R1+GFP组和R1+Nrf2 ShRNA组小鼠的逃避潜伏期没有显著的差异(P>0.05)。然而,NRF2的下调进一步增加了P8组小鼠的延长的逃避潜伏期(P<0.05,P8+Nrf2 ShRNA组)。在撤去水下平台后的空间探索实验中,R1+GFP组和R1+Nrf2 ShRNA组小鼠的穿越平台次数(6.2±1.04 vs 6.6±0.88),没有显著的差异(P>0.05)。P8组小鼠与R1组小鼠相比,穿越平台的次数明显减少(P<0.05),显示了更差的空间探索能力。而P8+Nrf2 ShRNA小鼠的穿越平台次数进一步减少(P<0.05,P8+Nrf2-Sh RNA group 1.6±0.72 vs P8+GFP group 3.8±0.64)。上述结果说明SAMP8小鼠老化的因素导致了其的学习记忆能力的下降。而Nrf2的下调进一步加剧了SAMP8小鼠的认知功能损害,而Nrf2的下调对SAMR1小鼠的认知功能没有产生明显的影响。3.避暗实验的结果实验各组的避暗结果显示了Nrf2对SAMP8小鼠情绪的影响。9个月的SAMP8小鼠与同年龄的SAMR1小鼠相比,电击次数(The times of the electric shock)增加。与P8+GFP组相比,,在P8+Nrf2-ShRNA组,电击次数显著增加(3.2±1.2vs2.7±0.99)。在P8+Nrf2-ShRNA group组比较P8+GFP group,P8+Nrf2-ShRNA组在逃避潜伏时显示了中等下降的趋势(P8+Nrf2-Sh RNA group vs P8+GFP group:168±62 s vs198±36s)。4.免疫组织荧光法检测海马中的Nrf2和MAP2。绿色荧光标记的Nrf2-ShRNA主要分布在海马神经元的细胞质中,但部分分布在细胞核中。这些结果证明了Nrf2-ShRNA在海马体中表达的稳定性和效率。MAP-2蛋白荧光检测用红色荧光标记。研究发现SAMP8小鼠海马区MAP-2阳性神经元数量比较SAMR1小鼠明显减少,说明老化使细胞骨架功能已受到影响。在P8+Nrf2ShRNA组,MAP-2表达强度与阳性面积在海马CA3区与P8+GFP相比明显降低,提示MAP-2依赖的神经元结构完整性在Nrf2下调时明显降低。第二部分下调海马内Nrf2对SAMP8小鼠突触结构可塑性及神经超微结构的影响目的:基于突触改变与认知功能的相关性,观察海马内下调Nrf2后对突触可塑性相关标志物的蛋白的改变和神经超微结构的影响,从而探讨Nrf2下降引起认知功能损害的机制。方法:1.实验动物及动物分组同第一部分。2.海马慢病毒注射5个月后,用蛋白印迹(westernbloting)的方法分别检测9月龄SAMR1和SAMP8组Nrf2及下游HO-1产物及P65的蛋白水平(n=5)。3.蛋白印迹(Western blotting)方法,观察9月龄SAMR1和SAMP8组小鼠海马组织PSD95、SYN蛋白水平的表达(n=5)。4.免疫组织荧光染色方法检测各组小鼠脑海马区域CA1区SYN的表达(n=3)。5.透射电镜观察超微结构下各组小鼠神经元与突触的结构改变(n=3)。结果:1.9月龄SAMR1和SAMP8组Nrf2,HO-1和P65的蛋白水平。在R1组和P8组,注射Nrf2shRNA慢病毒的组比较阴性对照GFP的组,总Nrf2蛋白(T-Nrf2)水平和核Nrf2(N-Nrf2)蛋白水平都有明显的下降。证明慢病毒下调Nrf2的表达在蛋白水平是稳定的。同年龄的SAMP8组比较SAMR1组,T-Nrf2与N-Nrf2是明显降低(P<0.05)。下游产物HO-1也表现出类似的趋势。NF-κB亚单位P65的表达在SAMP8小鼠显著增高,说明9月龄的SAMP8小鼠有NF-κB的活化的炎症反应。在Nrf2+ShRNA组,P65的增加比较Nrf2+GFP组有显著差异。(P<0.05)2.突触可塑性标志物PSD和SYN的蛋白表达水平。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马PSD和SYN的表达降低(P<0.05);与P8+GFP组相比,P8+Nrf2 ShRNA小鼠海马PSD和SYN蛋白表达水平进一步降低(P<0.05);3.在共聚焦显微镜下观察,结果显示在所有P8组SYN在海马CA1区的表达比较R1组明显的降低。而P8+GFP与P8+Nrf2 Sh RNA组相比,SYN的下降在Nrf2下调后下降的趋势更明显。同样的,通过western在蛋白水平上,PSD与SYN在P8组都是降低的,P8+Nrf2组下降的趋势更明显。4.透射电子显微镜下神经超微结构观察。神经元:SAMR1+GFP组小鼠海马CA1区神经元细胞器结构清晰完整,形态饱满。细胞膜完整,细胞质基质及核糖体分布均匀,线粒体膜及线粒体嵴结构清晰完整,粗面内质网呈现片层状或管泡状,高尔基复合体由4-8个平行排列的扁囊构成,表面光滑。细胞核核质均匀分布。SAMR1+Nrf2ShRNA小鼠海马神经元较SAMR1组细胞细胞器形态上无明显改变,基质内偶尔可见脂肪滴及脂褐素。SAMP8+GFP组小鼠海马神经元细胞膜及细胞器结构上尚完整,细胞基质分布尚均匀,但基质内可以见到不同程度的脂褐素沉积,符合老化的表现。核糖体数目减少,线粒体嵴形态僵硬,膜部分融合,粗面内质网轻度扩张,部分高尔基体结构模糊,细胞核出现固缩变形。P8+Nrf2ShRNA组小鼠呈严重老化表现,细胞基质内脂褐素明显增多,并可见自噬小体。线粒体形态僵硬,嵴趋于融合,提示线粒体功能降低。海马神经元细胞膜模糊不清,细胞质出现胞浆空泡化、苍白、基质不均匀。高尔基体萎缩,结构不清。各种细胞器如线粒体、内质网、高尔基复合体等数量明显减少。突触:SAMR1+GFP组小鼠与SAMR1+Nrf2ShRNA组突触无明显改变。突触数量较多,突触前膜、后膜及间隙结构清晰,突触之间的链接部位明显,突触小泡数量丰富。SAMP8+GFP组小鼠突触数量减少,突触结构欠清晰,突触小泡稀疏,PSD厚度增加,突触间隙宽度减小,偶尔可见突触前末端肿胀.P8+Nrf2ShRNA组小鼠突触数量明显减少,突触前膜肿胀并破坏,突触后膜增厚,突触间隙消失,突触小泡减少,提示突触的功能相对低下。第三部分下调海马内Nrf2对SAMP8小鼠海马组织内胶质细胞及炎症因子的影响目的:观察下调海马内Nrf2后,SAMR1及SAMP8小鼠海马内胶质细胞增生情况,及炎症因子的水平,从而明确Nrf2对神经炎症的影响,进一步探讨SAMP8小鼠认知功能下降的机制。方法:1.动物分组及模型制备同第一部分。2.运用免疫组织化学染色的方法检测小鼠海马部位CA1区域Iba1阳性面积和GFAP的阳性面积。3.Western检测各组小鼠海马IL-6,TNF-α蛋白水平的比较。结果:1.下调Nrf2后,在SAMP8小鼠的CA1区.Iba-1细胞聚集处的小胶质细胞突起较正常组小鼠粗大,突起数量增多,海马单位面积内Iba-1阳性细胞明显增加(P<0.01)。同样的,在CA1区,大量的GFAP反应性增加,形态上异常多样。2.western blot检测显示:与SAMR1小鼠相比,9月龄的SAMP8小鼠海马IL-6,TNF-α蛋白的表达增高(P<0.05);老化的SAMP8小鼠表现出了活化的炎症反应。在P8+Nrf2Sh RNA组,比较P8+GFP组,炎症因子TNF-α和IL-6蛋白水平进一步增加(P<0.05)。结果说明Nrf2的下降导致炎症因子升高,诱发了海马的神经炎症反应。结论:1.与同月龄SAMR1小鼠相比,行为学显示,9月龄SAMP8小鼠在学习记忆能力,情景记忆及恐惧记忆等认知域各方面受损。海马内注射慢病毒介导的ShRNA,下调海马内Nrf2蛋白水平对SAMR1小鼠的认知功能无影响。海马内Nrf2的敲减导致SAMP8小鼠的空间学习能力及情绪受损。说明Nrf2下调恶化了9月龄SAMP8小鼠的认知功能障碍。Nrf2在海马内的表达是影响认知功能的关键因素。2.与9月龄的SAMP8小鼠相比,同月龄的SAMP8小鼠接受慢病毒介导的Nrf2-shRNA后,海马突触相关蛋白、SYN和PSD,表达进一步减少,伴有海马神经元和突触的严重受损,说明海马的突触结构可塑性可能是下调Nrf2后SAMP8小鼠认知功能下降的神经生物学机制之一。3.下调Nrf2导致了SAMP8小鼠海马CA1区小胶质细胞和星形胶质细胞活化,TNF-α和IL-6.等炎症因子增加进而加重神经炎症。Nrf2的下调通过神经炎症-突触通路恶化了SAMP8小鼠的认知功能。