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乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)由美国FDA(Food and Drug Administration)认定为食品安全级酵母菌,具有营养要求简单、生长速率快、分泌蛋白能力强、蛋白适度糖基化等优点,是基因工程领域的优良宿主,广泛应用于食品和医药等领域。然而,很多由K.lactis表达的外源蛋白存在着产量低、活性差等问题,制约了该酵母的发展空间,而目前适用的表达载体种类少,选择较为局限,基础理论研究尚未成熟,因此亟待构建高效而便捷的分子工具,为该酵母遗传学研究及分子改造提供基础。本文通过考察不同启动子和信号肽在K.lactis中的功能,筛选性能优良的功能元件,并以18S rDNA为整合位点构建适用于K.lactis稳定的整合型表达载体。主要研究内容和结果如下:以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因,改造后载体pKLAC1*为基础,研究K.lactis来源启动子(pKlADH4、pKlMAL22)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源启动子(pScGAL7、pScPGK、pScTEF)和Spathaspora passalidarum来源启动子(pSpMAL1、pSpMAL6、pSpGAL1)在K.lactis中调控外源基因表达的能力。构建重组表达载体pKLAC1*-promoter-egfp,电转化K.lactis GG799,利用特异性引物PCR扩增法快速筛选不同启动子调控下的单拷贝整合重组菌,荧光检测结果表明,8种启动子均可不同程度调控绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,其中,pScGAL7调控下的荧光强度为2.92±0.07,高于当前应用最广泛的pKlLAC4(荧光强度为2.13±0.35),且在半乳糖诱导下,EGFP的表达量提高了57%,达到4.57±0.28,表明该启动子具有高效起始外源基因转录的能力。以来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)并经密码子优化的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)为报告基因,载体pKLAC1为基础,研究S.cerevisiae来源信号肽(SUC2、PHO5、KT)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)来源信号肽(INUSS)和K.lactis自身来源信号肽(αMF)在K.lactis中引导外源蛋白分泌表达的能力。构建重组表达载体pKLAC1-sp-AMPD,电转化K.lactis GG799,筛选不同信号肽引导下的单拷贝整合重组菌,胞外酶活测定结果表明,5种信号肽均成功引导重组菌AMP脱氨酶的分泌表达,其中αMF引导下酶活力最高,达到243.89±9.56 U·mL-1。在上述研究基础上,选定pScGAL7和αMF为功能元件,以质粒pMD 19-T simple为空骨架,K.lactis来源的18S rDNA为同源重组位点,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS,经Sac II线性化后去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的复制起始点(ori)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),电转化K.lactis GG799得到重组菌。利用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)测定重组菌的AMPD基因整合拷贝数为1至3。AMP脱氨酶酶活测定结果表明,酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活达到590±13.33 U·m L-1,提高了32.6%,该载体实现了外源基因的整合表达。在无选择压力下,重组菌传代58次稳定性达98.59%。这为以rDNA为整合位点的整合型表达载体在实际应用中奠定了理论基础。