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研究背景:放疗（radiation therapy,RT）至今仍是多种恶性肿瘤治疗的重要手段,其目标是彻底消除肿瘤或在降低肿瘤负荷的同时保留正常组织。40%的肿瘤患者会接受RT,用于治愈、局部控瘤或缓解症状。肺脏是胸部放疗最易损伤的器官之一,胸部放疗容易引起放射性肺损伤（Radiation-induced lung injury,RILI）,成为限制肿瘤患者胸部照射剂量的主要因素,是胸部放疗难以避免的并发症之一。RILI显著影响肺癌、乳腺癌、淋巴瘤或骨髓移植全身放疗患者的治疗,降低肿瘤控制概率（tumor control probability,TCP）并可能导致呼吸困难、肺纤维化,影响患者生存质量。近年来,得益于高精度放疗技术的进步、对RILI分子机制的深入了解,以及预防与治疗药物的不断发现,RILI的发病率有所下降,但是,仍然缺乏对RILI安全有效的防治手段。而且,许多针对RILI的防护药物往往也对肿瘤产生辐射防护的效果,限制了该类药物的临床应用。理想的辐射防护剂应对正常组织具有辐射防护作用,同时又不影响放射对肿瘤细胞的杀伤效果甚至能增加肿瘤的辐射敏感性。因此,能否找到这种具有“双向”作用的辐射防护剂或分子靶点也成为提高肿瘤放疗效果的关键所在。Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Rac1）,属于小分子鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatases,GTPases）Rho家族。既往研究表明,Rac1参与氧化应激与DNA损伤过程、与TGF-β通路关系密切、参与上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,以上生物学过程均为放射性损伤的重要机制。因此,Rac1可能是介导放射性损伤的重要分子,抑制Rac1可能对放射性肺损伤存在保护效应。另一方面,研究表明,多种肿瘤细胞存在Rac1过表达或突变,Rac1存在癌症相关功能获得性（gain-of-function,GOF）突变,不仅参与肿瘤形成、进展、侵袭及血管形成等多个方面,还介导肿瘤细胞对放化疗及免疫治疗的抗性。抑制Rac1可抑制肿瘤生长、恢复许多病例对靶向治疗的敏感性。综上,Rac1可能在放射性肺损伤的发生发展中具有重要作用,同时又对肺癌放疗产生重要影响,因此,抑制Rac1可能同时具有对正常组织的辐射防护潜力,还可抑制肿瘤生长、增加肿瘤对放疗的敏感性,是非常有前景的理想辐射防护分子靶点,这一研究国内外均无相关报道。本文一方面针对Rac1在胸部放疗所致肺损伤中的作用进行研究,从动物和细胞两个水平观察抑制Rac1对放射性肺损伤的防护效果,另一方面验证其对肿瘤放疗的影响。并进一步通过转录组测序及分析,筛选并验证Rac1下游的作用分子,从而阐明Rac1与放射性肺损伤及肿瘤放疗关系的作用机制。研究目的:探索抑制Rac1对放射性肺损伤的防护作用及机制,验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的差异效应,探索介导该差异效应的分子机制。研究方法:使用60Co放射源,构建放射性肺损伤小鼠模型,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766和H&E染色、Masson染色方法,研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织肺炎、肺纤维化程度的影响,并通过免疫组织化学染色法研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织DNA损伤标志物磷酸化H2AX（γ-H2AX）、放射损伤标志物TGF-β和EMT标志物vimentin的表达影响。使用小鼠正常肺上皮细胞系MLE-12,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766及构建Rac1敲除细胞系的方式,通过免疫蛋白印迹法（Western Blot,WB）研究放射后凋亡相关蛋白、细胞周期相关蛋白及DNA损伤相关蛋白表达变化,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率、PI/RNase染色法检测细胞周期分布、Ed U法检测细胞增殖活力,从细胞水平上验证抑制Rac1对放射性肺损伤的保护效应。通过转录组测序寻找抑制Rac1引起的差异基因表达,筛选抑制Rac1介导其效应的可能通路,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）法验证转录组测序结果,从细胞水平上研究介导Rac1差异作用的分子机制。进一步利用小鼠肺癌细胞系LLC研究抑制/敲除Rac1对肿瘤细胞的辐射增敏效应。最后,构建裸鼠皮下荷瘤模型、小鼠肺部原位荷瘤模型,结合使用Rac1抑制剂NSC23766,进一步在体验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的双向作用。研究结果:（1）Rac1抑制剂NSC23766可减轻小鼠放射性肺炎及肺纤维化;（2）抑制或敲除Rac1对MLE-12细胞的增殖活力无明显影响,可减少MLE-12细胞照射后凋亡、逆转MLE-12细胞照射后G2/M期阻滞、减轻MLE-12细胞照射后DNA损伤;（3）敲除Rac1可下调肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1（Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1,Trp53inp1）,过表达Trp53inp1可部分逆转敲除Rac1对MLE-12的辐射防护效应;（4）抑制或敲除Rac1可显著抑制LLC细胞增殖活力、增加LLC细胞照射后凋亡,对LLC细胞照射后周期阻滞无明显影响;（5）过表达Trp53inp1可协同敲除Rac1的促LLC凋亡效应,对小鼠肺癌细胞周期及增殖活力无明显影响;（6）肿瘤细胞LLC的Rac1表达显著高于正常肺上皮细胞MLE-12,且存在Rac1插入突变;（7）肿瘤细胞LLC的Trp53inp1表达显著低于正常肺上皮细胞MLE-12;（8）裸鼠皮下荷瘤及小鼠肺部原位荷瘤模型在体验证表明,抑制Rac1可显著抑制肿瘤细胞生长,同时对正常肺组织存在辐射防护效应。研究结论:抑制Rac1可减轻放射性肺损伤小鼠模型的放射性肺炎、肺纤维化,减少正常肺上皮细胞照射后凋亡、逆转照射引起的正常肺上皮细胞周期阻滞、减轻放射性DNA损伤,该效应部分通过下调Trp53inp1介导,过表达Trp53inp1可部分逆转抑制Rac1对正常肺上皮细胞的辐射防护效应。此外,抑制Rac1可显著增加小鼠肺癌细胞LLC对放射损伤的敏感性、显著抑制小鼠肺癌细胞生长。与正常肺上皮细胞相比,小鼠肺癌细胞Rac1过表达且突变、Trp53inp1表达显著降低,可能是介导抑制Rac1对正常细胞及肿瘤细胞差异效应的原因。