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在突发性的心血管事件中,及时恢复血流供应是挽救缺血心肌的关键措施,如冠状动脉搭桥术（bypass operation of coronary artery,CABG）,心肌梗死溶栓（myocardial infarction thrombolysis）、冠脉痉挛（coronary artery spasm）及心搏骤停行心肺复苏等,但血流恢复过程中,大量伴随的病理事件加重了心肌损伤,即心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。I/R损伤是心血管病中一个重要的病理过程,其机制至今未完全明确,除了炎性反应、钙超载、活性氧（reactive oxygen,ROS）和线粒体功能障碍等有关因素外,同时发现细胞膜离子通道蛋白的功能改变与I/R损伤有关,但目前确切的作用与机制尚不清楚。所以,进一步探讨心肌I/R损伤过程中离子通道的作用和机制,为临床I/R损伤的相关疾病提供新的、有效的治疗策略具有重要价值。自噬（autophagy）是细胞在营养缺乏或应激时降解自身蛋白和受损细胞器并经溶酶体包裹、消化,进行物质再循环利用的一种自我保护方式,在调控细胞损伤、老化和维护细胞内环境稳态方面起重要作用。自噬过强或不足均可引起心肌组织细胞损伤,导致心肌组织发生病理性改变或心脏功能异常。自噬性死亡是继细胞凋亡、坏死形式之后,一种新的溶酶体介导的程序性细胞死亡方式,其在心肌I/R中的调节作用受到了国际学术界的高度关注。在缺血/再灌注损伤中,自噬扮演着不同的角色,缺血期自噬轻度增加,具有一定的心肌保护作用,但再灌注期随着活性氧（ROS）持续升高,促进自噬异常增加,溶酶体相关蛋白（LAMP2）快速消耗,引发溶酶体功能障碍,导致自噬体不能被融合、消化,而在细胞内大量堆积,诱发心肌细胞自噬性死亡。近年来,研究发现细胞膜上各种离子通道蛋白在维护细胞内环境稳定与细胞的重要功能密切相关。本课题组前期在心肌细胞和在体心脏水平上,已证明阻断容积敏感性（VSOR）Cl-通道可抑制I/R过程中心肌凋亡的发生、减少心肌梗死面积,改善心脏功能,其主要机制是I/R导致ROS的增加,激活VSOR Cl-通道,而阻断VSOR Cl-通道也可抑制ROS水平,二者互为因果关系。然而,VSOR Cl-通道是否参与了自噬的调控,目前尚未见文献报道。本研究拟从细胞和在体两个水平I/R损伤心肌的模型上,通过改变氯通道功能,观察其对心肌细胞自噬水平的影响及调控机制。研究目的1.构建SD大鼠I/R损伤心肌梗死模型及原代大鼠心肌细胞模拟I/R损伤模型。2.探讨氯离子通道蛋白改变对心肌I/R损伤模型中心肌存活、心肌梗死面积及心脏功能的影响,进一步探讨自噬在该过程中的调控作用及机制。研究方法1.I/R模型构建:结扎雄性SD大鼠冠状动脉左前降支缺血30 min后,恢复灌注24-96h建立I/R模型。原代SD大鼠心肌细胞,采用缺血缺氧12h,再恢复血氧4h的方法模拟心肌细胞I/R损伤模型。2.实验分组:分为5组:对照组（Sham组）,缺血/再灌注组（I/R组）,I/R+NAC预处理组（NAC组）、I/R+DCPIB预处理组（DCPIB组）和I/R+3MA预处理组（3MA组）。各组分别在再灌注前10 min采用NAC、DCPIB及3MA进行预处理。3.生化分析仪检测血清心肌酶学指标。4.ELISA技术检测NF-κB和TNF-α水平。5.心脏超声检测大鼠心脏功能指标。6.伊文氏蓝和TTC双染色法检测心肌梗死面积。7.免疫组化、免疫荧光和Western-blot技术分别检测组织及细胞中LAMP2、LC3表达。8.应用荧光分光光度仪和荧光探针（DHE）分别检测组织及细胞中ROS水平。9.透射电镜检测组织细胞中自噬体和溶酶体。10.膜片钳全细胞记录技术为主检测心肌细胞VSOR Cl-电流变化。11.TUNNEL法检测心肌组织细胞的凋亡情况。12.MTT法检测细胞存活情况。13.Real-time PCR技术检测Beclin-1表达及脂质体转染沉默Beclin-1后表达水平。研究结果1.成功构建了SD大鼠I/R损伤心脏梗死模型和原代心肌细胞模拟I/R损伤的细胞模型。2.在体模型中,与Sham对照组相比,I/R组的心脏功能显著下降（P<0.05,n=6）;血清中CK、CK-MB和LDH,心肌组织ROS水平、炎性因子NF-κB、TNF-α表达、自噬小体及自噬蛋白LC3表达均明显升高（P<0.01,n=6）,而心肌梗死面积和LAMP2表达明显下降（P<0.01,n=6）。3.在体模型中,与I/R组相比,NAC组、DCPIB组和3MA组的心肌梗死面积显著下降（P<0.01,n=6）;血清中CK、CK-MB和LDH,心肌组织ROS水平、炎性因子NF-κB、TNF-α表达、自噬小体及自噬蛋白LC3表达均明显下降（P<0.05,n=6）,而心脏功能和LAMP2表达明显升高（P<0.01,n=6）。4.在体模型中,随再灌注时间的延长,LAMP2表达在不同组差异显著:I/R组24h内快速降低、3MA组在72h明显下降、而NAC和DCPIB组能持久维持LAMP2高表达（P<0.01,n=6）。心肌自噬小体数目与LAMP2表达强度成负相关（P<0.01,n=6）。5.原代心肌细胞I/R模型中,与sham组相比,I/R组中ROS水平、LC3表达、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率均明显升高（P<0.01,n=5）,LAMP2表达和细胞存活率显著下降（P<0.01,n=5）。6.原代心肌细胞I/R模型中,与I/R组比较,DCPIB组和NAC组可显著减少ROS生成、LC3表达、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率（P<0.01）,LAMP2表达和细胞存活率明显增加（P<0.05,n=5）;同时发现,在DCPIB干预下,即使通过增加H2O2（1μM）增强ROS含量,DCPIB仍能维持LAMP2表达,降低自噬水平（P<0.01,n=5）。7.原代心肌细胞I/R模型中,与DCPIB和NAC组比较,3MA组的ROS生成、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率均显著增加（P<0.05,n=5）,LAMP2表达和细胞存活率下降（P<0.05,n=5）。8.应用全细胞膜片钳技术记录H2O2模拟再灌注损伤VSOR Cl-特征性电流（ICl,vol）的产生:高电压呈时间依赖性失活、电流呈外向整流性特性、对氯通道阻断剂敏感性,DCPIB可显著阻断ICl,vol（P<0.01,n=5）;该电流也可被NAC显著阻断（P<0.01）,但3MA组仅部分阻断（P<0.05,n=5）。9.原代心肌细胞I/R再灌注模型中,si RNA沉默Beclin-1组与I/R组相比,可明显阻断自噬水平（P<0.01,n=5）;与DCPIB组比较,细胞存活率下降（P<0.01,n=5）。10.原代心肌细胞I/R再灌注模型中,与I/R组比较,DCPIB组可显著抑制ROS生成、降低LC3、Beclin-1 m RNA表达和TUNEL阳性率（P<0.01,n=5）,降低NF-κB表达活性（P<0.01,n=5）,持续维持LAMP2表达,细胞存活率明显增加（P<0.01,n=5）。研究结论1.成功构建了稳定的SD大鼠I/R损伤心脏梗死模型和原代心肌细胞模拟I/R损伤细胞模型,为进一步研究奠定了基础。2.阻断VSOR Cl-通道能够明显抑制I/R诱导的心肌损伤、增强心脏功能的保护,减少心肌梗死面积,其作用中除抑制了细胞凋亡的发生外,与抑制过度的心肌细胞自噬性死亡密切相关。3.阻断VSOR Cl-通道可明显抑制I/R诱导心肌自噬性死亡,其机制可能通过抑制ROS产生、阻断ICl,vol及降低NF-k B炎性因子的水平,部分抑制Beclin-1自噬通路,维持LAMP2高表达,减轻自噬体在细胞内堆积有关,从而达到保护心肌细胞的作用。