【摘 要】
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蜘蛛丝具有优越的力学性能,在生物医药、军工及航空航天领域有广泛的应用前景。目前利用基因工程技术表达蛛丝蛋白,并通过人工纺丝获取重组丝纤维已成为主流。但蛛丝蛋白重复序列多,天然成丝机理尚未研究透彻,人工纺丝工艺相较于天然成丝的过程差异较大,这些因素导致仿生蛛丝难以复制出天然蛛丝的全部特性。为进一步探索更接近天然蛛丝性能的重组丝纤维,本课题首先选择了实验室已有的嵌合蛋白FAc为研究对象,其由大腹园蛛鞭
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蜘蛛丝具有优越的力学性能,在生物医药、军工及航空航天领域有广泛的应用前景。目前利用基因工程技术表达蛛丝蛋白,并通过人工纺丝获取重组丝纤维已成为主流。但蛛丝蛋白重复序列多,天然成丝机理尚未研究透彻,人工纺丝工艺相较于天然成丝的过程差异较大,这些因素导致仿生蛛丝难以复制出天然蛛丝的全部特性。为进一步探索更接近天然蛛丝性能的重组丝纤维,本课题首先选择了实验室已有的嵌合蛋白FAc为研究对象,其由大腹园蛛鞭毛状腺丝蛋白（flagelliform spidroins,Flag）的重复模块和三带金蛛的葡状腺丝蛋白（aciniform spidroins 1,Ac Sp1）的重复模块构成。该嵌合蛛丝蛋白纤维杨氏模量超越了天然葡状腺丝,其应力约是天然葡状腺丝的1/3,但应变和韧性较差。已有研究表明增加重复区的数量可提高蛛丝的机械性能,但大多为单一类型蛛丝的重复模块进行重复,对不同类型蛛丝蛋白的模块进行组合重复的报告较少,为此本课题在嵌合蛋白FAc的基础上对其重复模块进行组合重复,进一步构建了嵌合表达质粒p EHS-FAc-FAc和p EHS-FAc-FAc-FAc,转化入大肠杆菌中表达并通过镍柱进行纯化。手工拉丝获取FAc-FAc丝纤维,扫描电子显微镜显示其纤维直径均匀且外表光滑。进而对丝纤维的机械性能进行测试,对比嵌合蛛丝蛋白FAc,发现叠加重复模块进对蛛丝纤维力学性能均有不同程度的提升,尤其是韧性提高了近3倍,平均可达122.28 MPa,杨氏模量仍能与天然葡状腺丝相当。结构分析表明,由蛛丝蛋白液到蛛丝纤维的过程中主要二级结构变化为由α-螺旋转变到β-折叠,与以往的研究报告结果相符。但FAc-FAc-FAc可能由于分子量太大、重复序列多,未在大肠杆菌中成功表达,后续我们将尝试利用反式剪接技术对其表达连接。本课题证明了在不含非重复的N端模块（NT）和C端模块（CT）的情况下,叠加重复模块可有效促进丝纤维的机械性能,在一定程度上为设计高性能嵌合蛛丝纤维提供新思路。同时,为进一步拓展功能化蛛丝纤维的应用范围,本课题利用基因工程技术将红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）融合至已有的嵌合蛛丝蛋白（NRC和NRRC）的上游,制备功能性仿生蛛丝。其中,NRC和NRRC嵌合蛛丝蛋白分别含有1-2个大腹园蛛梨状腺丝蛋白（Pyriform Spidroin,Py Sp）的一个重复区R,两侧有来自次壶状腺丝蛋白（minor ampullate spidroin,Mi Sp）的NT和CT,该嵌合纤维表现出较强的抗拉伸强度。经大肠杆菌表达系统表达,通过变性纯化的方式获得了目的蛋白RFP-NRC和RFP-NRRC。借助湿纺纺丝获取了可发出强烈红色荧光的丝纤维,且在湿纺过程中对凝固浴的含水量与丝纤维力学性能之间的关系进行探索,结果表明,在一定范围内含水量越高的凝固浴,获得的丝纤维综合性能越优异;与不含红色荧光蛋白的丝纤维进行对比,蛛丝纤维的应力、杨氏模量均有提高,提升最为突出的是韧性,达到了177.56±33.96 MPa。表明获得的红色荧光蛛丝纤维,仍能保持优异的机械性能,RFP的融合对丝纤维的机械性能和二级结构的影响较小。该功能性荧光蛛丝材料有望用于定位和视踪,再结合蛛丝自身抗菌等特性,可促使功能性蛛丝纤维能更广泛地应用于生物医学等领域,为功能性且高性能的蛛丝纤维提支持。综上所述,本研究通过叠加蛛丝蛋白的重复模块成功获得了高性能的蛛丝纤维,为今后高性能嵌合蛛丝的的应用提供理论支持。此外,通过将红色荧光蛋白与蛛丝蛋白相融合,成功获得了高性能红色荧光蛛丝纤维,为荧光蛛丝纤维进一步的研究与应用奠定基础。
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