研究背景：内皮细胞(EC)迁移在血管生物学中是一项基本的生理过程,在胚胎的生长发育、血管生成/新生、后天的损伤修复以及诸多疾病的病理过程中都扮演着重要的角色。促进内皮细胞迁移不仅对治疗性血管新生非常重要,同时对加速血管损伤后的再内皮化和制造有稳定功能的人造血管也有至关重要的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是调节内皮细胞功能最重要的因子,在内皮细胞的迁移过程中有不可取代的作用。PTP1B是酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族的重要成员,也是在内皮细胞中高表达的PTP。PTP1B是VEGF信号通路中非常关键的负调控因子。近期,多项研究表明抑制PTP1B可以增强血管内皮生长因子2型受体(VEGR2)的信号传导,从而促进内皮细胞迁移和血管新生。然而,PTP1B的底物非常广泛。目前,我们还不清楚除了通过影响VEGFR2信号通路,PTP1B抑制剂是否还能通过其他机制影响内皮细胞的迁移功能。在本次研究中,我们证实了PTP1B印制剂可不通过VEGFR2信号通路而直接促进内皮细胞的运动的假说。利用人内皮细胞做研究对象,我们证实了PTP1B抑制剂可以促进内皮细胞的黏附、伸展和迁移,这些作用可以被小G蛋白Racl的抑制剂阻断,而RhoA的抑制剂则没有明显作用。PTP1B印制剂显著增加了p130Cas的磷酸化以及p130Cas,Crk和Dock180之间的结合作用。然而,PTP1B抑制剂处理后,黏着斑激酶(FAK),Src, paxillin口Vav2的磷酸化水平却没有改变。对DOCK180进行基因沉默后,PTP1B抑制剂对内皮细胞运动功能的影响消失,而对Vav2基因沉默后却没有上述现象。在VEGFR2抑制剂存在的情况下,PTP1B抑制剂对内皮细胞运动功能的促进和对p130Cas/DOCK180的激活作用依然存在。根据以上结果,我们认为DOCK180通路的激活是PTP1B抑制剂影响内皮细胞运动的另一机制,这一机制并不以VEGFR2通路的激活为必要条件。因为心血管病人体内VEGF/VEGFR的功能通常呈现受损状态,因此对于这些病人来说,PTP1B抑制剂可能作为一种新的治疗药物用于促进内皮细胞的迁移功能。研究目的：1.研究PTP1B抑制剂对内皮细胞运动功能的调控作用。2.明确PTP1B抑制剂对内皮细胞运动的作用是否绝对依赖于VEGFR2信号通路的激活。3.探索PTP1B抑制剂调节内皮细胞运动功能的信号传导机制。研究方法：1.试剂3-(3,5-二溴-4-羟基苯甲酰)-2-乙基-N-[4-(1,3-噻唑-2-氨磺酰))苯基]-1-苯并呋喃-6-磺酰胺(PTP抑制剂22),Rhosin和NSC23766, PP2, and Ki8751均购自Merck Millipore (Darmstadt, Germany)。 TCS401购买自Tocris Bioscience (Bristol,UK)。2.细胞培养人脐静脉内皮(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)及端粒酶-永生化人微血管内皮细胞(Telomerase-immortalized Human Microvascular Endothelial, TIME)细胞均购买自美国ATCC公司。以完全内皮细胞培养基(ECM),加入5%胎牛血清、内皮细胞生长因子(100U/m1)及青链霉素((100 μg/ml),于温度37℃,CO2浓度5%的细胞培养箱中进行培养。细胞密度达到70%-90%时进行传代培养,选择3-6代的HUVECs用于试验。3. Transwell细胞迁移试验Transwell迁移试验采用Boyden小室法。将细胞消化后重悬于无血清培养基中,计数并调整细胞数目。向上室中加入105个细胞,下室中添加终浓度为1%胎牛血清作为趋化因子。在细胞孵箱中孵育6小时,用冰甲醇固定迁移穿过膜的细胞,之后用结晶紫染色。显微镜下,每孔取5-10个高倍(400X)视野照相并计数。所有实验均重复至少3次,上下小室均加入药物刺激和对照。4.细胞黏附试验以含有0.1% DMSO和10μM PTP Inhibitor ⅩⅫ的无血清培养基对细胞进行预处理。1小时后,用胰酶消化细胞,离心后将细胞重悬于含有处理因子的培养基中,接种于24孔板。30分钟后,用PBS冲洗,去除没有贴壁的细胞。向24孔板中加入冰甲醇固定细胞,固定完成后用1%的结晶紫染色。高倍镜下,每孔取5-10个随机视野拍照,对黏附的细胞进行计数。5.细胞伸展试验以含有0.1%DMSO或目的药物的无血清培养基对细胞进行预处理1小时。之后将细胞种在Lab-Tek8孔腔室玻片上(8-well Lab-Tek II chamber slides Thermo Scientific, Waltham, MA, USA),加入与预处理相同的刺激,继续孵育1小时。1小时后,用4%多聚甲醛固定细胞,然后用罗丹明标记的鬼笔环肽(购自Cytoskeleton, Denver, CO, USA)和DAPI对细胞进行共染色。染色完成后,在共聚焦显微镜(Model LSM710, Zeiss, Jena, Germany)下进行观察和图像采集。采用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)测量细胞的平均面积。每次试验均截取150-200个来自随机视野内的细胞进行统计分析。此外,为了对细胞的伸展活动进行实时观测,我们首先将TIME细胞以PTP1B抑制剂或0.1% DMSO的无血清培养基预处理1小时。之后将细胞消化,重悬于含有上述刺激的无血清培养基中。将细胞种在胶原Ⅰ包被的6孔板中,调整细胞数为105/孔。静置3分钟使细胞沉降并轻微贴壁,之后将细胞置于装有佳能数码相机的相差光学显微镜(Olympus Lifescience, Tokyo, Japan)下录像20分钟。6.细胞活性检测进行细胞活性检测时,先将细胞在96孔板中培养至约100%密度,药物处理后,应用CellTiter 96 Aqueous kit试剂盒(购自Promega, Madison, WI, USA),按照其提供的方法进行检测。检测细胞增殖时,将内皮细胞种于96孔板中,2000-3000个/孔。按观察天数分组,每组5个复孔,隔天更换含有药物或0.1%DMSO(对照)的培养基。每天用CellTiter 96 Aqueous kit试剂盒检测,记录OD值,绘制生长曲线。7.小G蛋白活性试验将细胞培养至密度约80%。首先用无血清培养基清洗细胞,然后依照试验分组,以含有0.1%DMSO或10μM PTPI22的无血清培养基孵育20或40分钟。采用EMD Millipore公司的Racl活性试剂盒(Billerica, MA, USA)分离和纯化激活状态的Racl。我们以购自Cell Signalling Technology (Cat# 2465) (Beverley, MA, USA)的anti-Racl抗体代替试剂盒提供的抗体做Western blot检测。8. siRNA转染针对DCOK180或Vav2的siRNA片段(各3个序列)均购自GenePharma (Shanghai, China)。 siRNA转染采用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA),依照其提供的步骤进行,并以Western blot检验转染效率。相关试验均在转染后48小时进行。9.蛋白质免疫印迹和免疫沉淀细胞密度达80-90%后进行相应药物刺激,处理完成后,加入预冷的细胞裂解液进行总蛋白提取。细胞裂解液配置如下：50mM Tris pH 7.5,2mM EDTA,100 mM NaCl,50 mM NaF,1% Triton X-100,1 mM Na3V04,40mMβ-甘油磷酸钠,使用前加入蛋白酶抑制剂混合物(Roche, Mannheim, Germany)。进行免疫沉淀时,先将各组蛋白调整至浓度一致并进行预纯化,之后分别向各样本中加入2μg抗体和20μl 50%蛋白A/G琼脂糖小珠悬浊液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA),并置于4℃环境下轻柔颠倒混匀过夜。次日,先以预冷的细胞裂解液清洗琼脂糖珠,之后加入3X的上样缓冲液煮沸。以SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭后,一抗4℃孵育过夜,次日加入二抗室温孵育2小时。TBS清洗3次后,用ECL化学发光液(GE, Piscataway, NJ, USA)显影,并LAS-4000化学发光仪下检测目的条带(Fujifilm,Stamford, CT, USA)。以Image-J软件(NIH)分析目的蛋白及内参条带的灰度值,并进行统计和比较。试验所用抗体如下：anti-phospho-tyrosine (#9411), Src (#2110), FAK (#3285), Vav2 (#2848)和p130Cas(#13383)均购自Cell Signalling公司; anti-Src (abl09381)和Crk(ab133581)购自Abcam公司(Cambridge, UK); anti-paxillin (#05-417)购自EMD Millipore公司；anti-Tiaml (AF5038)购自R&D Systems(Minneapolis,MN, USA); anti-DOCK180 (sc-6167)购自Santa Cruz公司(Dallas, Texas USA).10.免疫荧光将细胞培养于Lab-Tek 8孔腔室玻片上,药物处理后以多聚甲醛固定,固定完成后以PBS冲洗,5% BSA封闭。之后加入5% BSA稀释的anti-Crk或anti-Dock180一抗(稀释比例1：100)孵育过夜。次日,加入5% BSA稀释的Alexa Fluor 488或594免疫荧光二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA),室温孵育2小时。二抗孵育完成后,加入DAPI染细胞核15分钟。共聚焦显微镜下进行免疫荧光图像采集。11.数据统计所有数据均来自至少三次独立的实验结果,并以平均值±标准误(S.E.M.)的形式表示。两组和多组数据统计分别采用非配对t-检验和单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05时认为有统计学意义。所有检验均为双尾检验。研究结果：1. PTP1B抑制剂增强了内皮细胞的黏附和伸展PTP抑制剂22 (PTPI22)是一种细胞通透性的选择性PTP1B抑制剂。首先,我们采用不同浓度的PTPI22处理TIME细胞24或48小时,发现低于20μM的浓度对细胞是没有毒性作用的。接下来的实验,我们选用10μM的浓度作为试验浓度。PTPI22刺激TIME细胞后,发现TIME细胞在胶原Ⅰ包被界面的黏附和伸展运动显著增强。为了连续观察细胞的伸展运动,我们在显微镜下对PTPI22处理组和对照组细胞伸展运动进行录像,结果显示PTPI22显著加快了TIME细胞的伸展运动。为了进一步确认PTPI22的作用,我们用HUVECs重复上述实验,证实PTPI22同样也促进了HUVECs的黏附和伸展。我们在没有胶原包被的界面上重复上述实验,结果显示PTPI22依然可以促进细胞的伸展和黏附。此外,我们还选取了另一种PTP1B抑制剂TCS401重复上述实验,得到了相似的结果。2. PTP1B抑制剂促进内皮细胞迁移我们采用PTPI22和TCS401处理细胞后,以血清为趋化因子,采用Boyden chambers法检测内皮细胞的迁移。结果证实,两种药物都可以促进内皮细胞迁移。3.抑制VEGFR2后PTP1B抑制剂的作用依然存在用VEGFR2抑制剂Ki8751(2nM)预处理细胞后,VEGF诱导的Erkl/2水平明显下降,提示Ki8751有效的阻断了VEGF/VEGFR2通路。Ki8751预处理明显抑制了TIME细胞的伸展反应,但加入PTPI22后,TIME细胞的伸展反应仍然增强。说明PTPI22在VEGFR2信号通路阻断的情况下依然能够促进内皮细胞的运动。为了进一步证实这一结论,我们进行Transwell细胞迁移试验。结果显示,Ki8751可以明显降低内皮细胞的迁移能力,但PTPI22处理后内皮细胞的迁移依然增强。4. PTP1B抑制剂对内皮细胞运动的作用是Racl依赖的Racl抑制剂NSC23766 (100μM)处理细胞后,显著降低了内皮细胞的伸展面积。同时,Racl抑制剂能够消除PTP122对细胞伸展的促进作用。PTPI22处理TIME细胞后,Rac1活性显著增强。同时,Ki8751处理阻断VEGF/VEGFR2通路后,PTPI22依然可以增强Rac1的活性。然而,应用另一小G蛋白Rho的抑制剂Rhosin处理细胞后,却不能消除PTPI22对细胞伸展的促进作用。此外,迁移试验结果显示NSC23766可以消除PTPI22对细胞迁移的促进,而Rhosin同样没有这项作用,进一步证实了PTP1B抑制剂对内皮细胞运动的促进作用是Racl依赖的。5. PTP1B抑制剂并未改变内皮细胞FAK, Src,Paxillin的磷酸化水平FAK/Src通路与VEGFR2通路都能够调节Racl的活性和细胞的运动,因此我们利用免疫沉淀和蛋白免疫印迹实验,检测PTPI22处理后FAK,Src和其下游Paxillin的磷酸化水平。然而,结果显示PTPI22并未改变细胞内FAK,Src和Paxillin的磷酸化水平。此外,我们还证实了Ki8751可以显著降低正常细胞内,FAK和Paxillin的磷酸化。6. PTP1B抑制剂的作用是DOCK180依赖的小G蛋白的活性受到鸟苷酸转换因子(Guanine nucleotide Exchange Factor,GEF)的调控,Racl主要的GEF包括DOCK180、Vav2和Tiaml。为了明确是哪种Racl的GEF在PTPI22诱导的一系列现象中起作用,我们用蛋白免疫印迹和免疫沉淀检测了转换因子DOCK180,Vav2和Tiaml。结果显示,DOCK180可以用蛋白免疫印迹的方法轻易的检测到,说明其在TIME细胞中表达量较高。Vav2在免疫沉淀富集后方能检测到,说明其表达量较少。而Tiaml即使用免疫沉淀富集后,依然检测不到,提示其在内皮细胞中表达量极低。我们采用siRNA干扰方法对DOCK180和Vav2进行基因沉默。结果显示,对DOCK180进行基因沉默显著降低了PTPI22引起的细胞伸展面积和细胞迁移。相反,对Vav2的基因沉默并未影响PTPI22的作用。此外,我们未能检测到内源性的Vav2磷酸化,PTPI22处理也未能提高其磷酸化水平。7. PTP1B抑制剂增加了p130Cas的磷酸化水平,以及p130Cas-Crk-Dock180之间的相互作用p130Cas和Crk是DOCK180的结合伴侣,结合并激活DOCK180。同时,p130Cas是PTP1B的底物。因此,我们推断PTPI22可能通过p130Cas激活DOCK180。首先,我们检测了p130Cas的磷酸化水平。PTPI22处理显著增加了p130Cas的磷酸化水平,Ki8751处理后PTPI22的作用依然存在。免疫沉淀Crk证实了PTPI22处理后,Crk与p130Cas和Paxillin的结合增强。细胞免疫荧光显示PTPI22处理促进Crk转位,提示Crk激活。同时,免疫荧光共定位显示Crk和DOCK180结合增多。此外,免疫共沉淀显示PTPI22处理后,DOCK180与p130Cas/Crk的结合增多,Ki8751处理后PTPI22的作用依然存在。虽然,我们检测Src的磷酸化并未受到PTPI22处理的影响,但有趣的是,用抑制剂PP2抑制Src后,PTPI22对细胞迁移的促进作用却降低了。结论：1. PTP1B抑制剂促进内皮细胞的黏附、伸展和迁移。2. PTP1B抑制剂在VEGFR2通路阻断的情况下,依然能够促进内皮细胞的运动。3. PTP1B抑制剂促进内皮运动的作用是通过DOCK180/Rac1通路介导的。