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皮肤是人体最大的器官,负责维持机体稳态和防止外来病菌入侵,却最容易受到机械创伤、化学物质、高温等的伤害。全层皮肤损伤是涉及到真皮层甚至皮下肌肉的损伤,在短时间内很难修复,治疗不及时会引起伤口愈合过程变缓,导致慢性伤口的形成从而加重病人及家庭的负担。在临床上,治疗全层皮肤损伤通常采用皮肤移植的治疗手段,但是伴随着成本过高、来源有限、免疫原性等问题的限制。因此,开发品质优良的的伤口敷料是临床治疗的迫切需求。水凝胶具有良好的生物相容性,可以有效吸收伤口浸出液,维持损伤部位潮湿环境,促进氧气、水分、养料的交换等特点,在皮肤组织工程研究中得到广泛的关注。与传统的水凝胶敷料相比,可注射性水凝胶能填充任意深度和形状的伤口,可以更好地发挥作用。透明质酸（Hyaluronic acid,HA）是细胞外基质的重要成分,具有良好的生物相容性和高保湿性,在伤口愈合过程中扮演着重要的角色,如调节免疫反应、促进细胞增殖和上皮再生等。但是HA水凝胶与皮肤组织的粘附性较差,容易从伤口部位脱落。受天然贻贝高粘附性能的启发,将多巴胺（Dopamine,DA）接枝到HA分子上,将赋予HA水凝胶良好的组织粘附性以及抗氧化性。羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitosan,CMC）是壳聚糖的改性产物,它克服了壳聚糖在生理p H环境下难溶的问题,保留了易成膜性、高保湿性、生物相容性和止血性等优点。因此,本文采用CMC和接枝DA的HA经化学交联制备水凝胶,并研究其对小鼠全层皮肤损伤的修复作用。目的本课题拟采用多巴胺修饰透明质酸获得聚合物（HA-DA）,利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和H2O2催化CMC和HA-DA聚合物交联形成一种可注射的CMC/HA-DA水凝胶,并对其物理化学性能进行表征;在全层皮肤损伤小鼠模型体内原位注射水凝胶,从宏观和微观分子水平研究其对小鼠损伤皮肤的修复作用。方法第一部分:CMC/HA-DA水凝胶的制备及表征基于EDC/NHS偶联法合成HA-DA,利用核磁共振氢谱、傅里叶变换红外光谱和紫外分光光度法对HA-DA产物进行分析并计算DA的接枝率;通过HRP/H2O2催化交联制备三种CMC/HA-DA水凝胶（CMC/HA-DA1,CMC/HA-DA2,CMC/HA-DA3）用于分析原料配比与性能变化的关系;扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察水凝胶的内部微观结构;倾斜法测定水凝胶成胶时间;冷冻干燥法测定水凝胶的含水率;称重法测定水凝胶的降解率;酶解法测定水凝胶的生物降解性;旋转流变仪测定水凝胶的弹性模量;利用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羟基自由基的方法检测水凝胶的抗氧化性能;利用万能材料测试机与有机/无机材料检测水凝胶的粘附性;CCK-8法和钙黄绿素（Calcein-AM）/碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色法检测水凝胶对L929细胞和Ha Ca T细胞的毒性作用。第二部分:CMC/HA-DA水凝胶体内促进皮肤损伤修复的作用与机制通过溶血实验检测水凝胶的血液相容性,体外全血凝血实验和小鼠肝出血止血实验检测水凝胶的止血性能;综合水凝胶的成胶时间、稳定性、生物相容性等指标,选择CMC/HA-DA2水凝胶用于后续动物实验。将水凝胶注射到小鼠皮下,在第3、7、14天检测水凝胶在体内的降解情况,利用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色分析水凝胶注射部位周围肌肉组织的炎症反应以及小鼠主要器官的形态学变化。构建小鼠全层皮肤损伤模型后并将小鼠随机分组,在造模治疗后第0、3、7、14天拍照记录并统计伤口愈合情况。在第14天取出小鼠病灶组织,HE染色分析皮肤伤口愈合情况;Masson染色分析损伤部位的胶原沉积;免疫组化分析损伤部位炎症反应和血管再生;免疫荧光分析损伤部位血管生成和上皮组织的细胞增殖;Western blot检测炎症和血管再生相关蛋白的表达。结果第一部分:CMC/HA-DA水凝胶的制备及表征1、HA-DA高分子聚合物的紫外吸收光谱和核磁共振氢谱均出现DA的特征信号,傅里叶变换红外光谱中出现酰胺键的特征峰,这三种表征手段均表明HA-DA聚合物接枝成功,且DA的接枝率为142.8μmol/g。2、CMC/HA-DA水凝胶具有可注射性,能够与皮肤损伤病灶边缘紧密吻合,内部呈疏松的网状多孔结构;三组水凝胶成胶时间在1～5 min,含水率均在95%以上,弹性模量分布在80～300 Pa,具有可降解性能;水凝胶具有抗氧化性能,对DPPH自由基和羟基自由基具有清除作用;CMC/HA-DA的成胶时间、体外降解率和酶解速率均与HA-DA浓度成反比,弹性模量、对DPPH自由基和羟基自由基的清除率与其浓度成正比。3、CMC/HA-DA水凝胶对无机材料（塑料、玻璃、铁、橡胶、木头）和有机物（心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织器官）均具有粘附作用。4、L929细胞和Ha Ca T细胞与CMC/HA-DA水凝胶浸提液共培养24和72 h后,两种细胞的的存活率均在80%以上,证明水凝胶具有良好的细胞相容性,可用于再生医学领域。第二部分:CMC/HA-DA水凝胶体内促进皮肤损伤修复的作用与机制1、CMC/HA-DA水凝胶的溶血率小于5%,低于生物材料溶血率的国际标准;体外实验结果表明水凝胶可以有效促进凝血块的形成;小鼠肝出血模型实验结果显示水凝胶可通过减少血液流失量和缩短止血时间达到止血目的。2、在小鼠皮下注射CMC/HA-DA2水凝胶,第3、7、14天观察到注射部位周围肌肉组织没有发生明显的炎症反应,水凝胶的降解产物对心、肝、脾、肺、肾未造成损伤,表明其组织相容性良好。3、成功构建小鼠全层皮肤损伤模型,与Control组和TegadermTM film（3M Tegaderm（?）Transparent Film Dressing）组相比,CMC/HA-DA水凝胶组能有效地促进伤愈部位上表皮再生,毛囊形成,胶原蛋白沉积,加速伤口愈合。免疫组化分析结果显示水凝胶组可以促进α-SMA的表达,从而促进血管再生,与此同时抑制MMP-9的表达减轻炎症反应。免疫荧光结果显示水凝胶能促进PCNA和CD31的表达,进一步证明其能够促进上表皮细胞的增殖与伤愈部位的血管再生。4、与Control组和TegadermTM film组相比,CMC/HA-DA水凝胶组能够通过下调炎症因子IL-6的表达和上调IL-10的表达来调节炎症反应,上调VEGF的表达促进血管生成。结论1、CMC/HA-DA可注射水凝胶具有稳定的疏松多孔样结构,较高的含水率和稳定性,成胶时间符合应用需求,且具有良好的粘附性、生物相容性、生物降解性、抗氧化性与止血性等多种特性。2、CMC/HA-DA水凝胶可促进小鼠皮肤损伤部位上表皮及皮肤附属物的再生,促进胶原沉积和血管再生,并调节炎症反应,从而加速全层皮肤损伤的修复。