维生素K2(VK2)是一种人体必需的脂溶性维生素,在人体内能快速被肠道吸收,可增加身体骨骼的密度,防止骨骼疏松,同时也能够有效降低心脏病和心血管硬化的发病率。由于化学法合成维生素K2存在环境污染等问题,在许多地区国家被限制不能直接应用于食品中。而微生物发酵法合成维生素K2,因具有发酵原料易得、发酵条件温和、环境压力相对较小,并且该类维生素来源于生物自身,因此具有高生物活性和高生物相容性等优点,成为当下维生素K2合成的首选方法。然而目前微生物发酵法生产维生素K2存在菌种活力低、生产成本高等问题,制约着微生物法制备维生素K2的工业应用。为攻克上述难题,本论文开展了如下研究:(1)维生素K2优势菌株的诱变选育通过对初筛菌株枯草芽孢杆菌168(B-S-1)进行常压室温等离子体诱变,并进行结构类似物抗性初筛和24孔板发酵复筛,获得一株维生素K2优势突变株枯草芽孢杆菌(B-S-2),维生素K2产量达到11.30±0.58 mg/L。传代稳定性试验表明,经诱变后获得的维生素K2优势突变株B-S-2在产量方面保持较高的传代稳定性。(2)优势菌株关键基因调控对维生素K2合成能力的影响通过敲除支路基因dhbB,过表达维生素K2代谢合成限速通路2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径关键基因ispG、ispH、ispA,以及连接主侧链结合的关键基因menA,构建得到重组菌株BS9,维生素K2产量达到28.36±0.96 mg/L,是原始菌株的8.03倍。(3)维生素K2优势菌株BS9摇瓶发酵工艺的优化经过单因素试验后,确定了碳氮源以及无机盐的最优浓度范围,再采用响应面法设计,结合统计软件对数据进行运算处理和响应值预测,发酵最优工艺为:KH2PO4 0.69 g/L,甘油66.01 g/L,酵母粉25.12 g/L,在此条件下维生素K2预测的最大产量为33.58 mg/L。为验证该最优工艺参数,经3组重复实验,维生素K2产量为33.26±1.23 mg/L,该值与响应面实验的预测值接近。(4)两阶段转速调控策略及发酵动力学模型的建立为研究探讨摇床转速对枯草芽孢杆菌产维生素K2的能力,设定0r/min,100 r/min,200r/min,300 r/min四种不同的摇床转速。根据菌体比生长速率和维生素K2比合成速率在不同转速下的变化规律,提出了一种两阶段转速调控策略:在0-30 h,调节转动速度在300 r/min,发酵30 h后,调节转动速度在0 r/min,168h后维生素K2的产量达到44.35±0.59 mg/L,是原始菌株的12.6倍。