羊膜间充质干细胞(hAMSCs)具有获取方便、对供体无伤害、免疫耐受、无伦理道德问题等特点,使其成为继骨髓间充质干细胞(BMMSCs)之后另一备受关注的间充质干细胞(MSCs),在组织工程、细胞治疗和基因治疗等方面具有广阔的应用前景。然而众所周知,由于组织中hAMSCs含量极少,且在体外长期扩增过程中易于丧失自我更新能力和多向分化潜能,因此其在临床上的应用受到严重限制。在hAMSCs培养过程中,众多因素影响细胞扩增和分化,其中营养物耗竭和代谢副产物累积所导致的培养环境恶化是限制／抑制细胞扩增和分化的主要问题之一。乳酸是细胞消耗葡萄糖等营养物时的代谢副产物,在动物细胞培养过程中对细胞生长、代谢和产物生成具有显著影响,同时它也是组织工程中聚乳酸(PLA)等可降解生物材料的降解产物,无疑会对细胞扩增和分化产生重要影响,但在干细胞和组织工程领域人们对乳酸的作用,特别是它对hAMSCs扩增和分化的影响及其调控作用,却知之甚少。此外,目前常规的培养方式一般在方瓶或平皿中进行静态培养,不仅细胞生长面积有限,而且还因缺少流体混合,造成培养环境不均一,加之需要频繁的消化传代等操作,难以实现细胞规模化扩增和定向诱导分化,而且收获细胞的均一性也往往无法保证,因此平面单层培养很难满足实验研究和临床应用对细胞数量和质量及定向诱导分化的要求。为此,深入认识hAMSCs生长、代谢和分化的特性,了解培养环境对细胞生理状态和维持干细胞特性的影响,是解决上述问题的前提,也是本文研究工作的核心所在。首先,本文分别在常氧和低氧环境下考察hAMSCs的扩增和成骨诱导分化能力以及在扩增和成骨诱导过程中代谢副产物乳酸的生成,并将之与BMMSCs进行对照。实验发现,氧环境对hAMSCs的影响与BMMSCs一样,低氧环境更有利于细胞扩增；然而低氧环境却不利于hAMSCs的成骨诱导分化,导致大量细胞死亡脱落。另外,hAMSCs在低氧环境下扩增时较常氧下产生了更多的乳酸,在培养后期乳酸浓度达到约15mmol/L,且其乳酸比生成速率及乳酸对葡萄糖的得率分别为常氧组的1.89和1.45倍；在常氧环境下诱导hAMSCs成骨分化也会产生大量的乳酸,特别在诱导后期乳酸浓度超过15 mmol/L。鉴于hAMSCs在体外扩增和成骨诱导分化过程中均有大量乳酸生成和积累,为此本文进一步考察了乳酸对hAMSC体外扩增、代谢、集落形成能力以及成骨诱导分化等产生的影响及其机制。同样地,在实验过程中BMMSCs作为参照。结果表明,乳酸浓度在10 mmol/L以上时,对hAMSCs体外扩增、集落形成能力、葡萄糖消耗和乳酸生成等均有抑制作用,并且发现乳酸的这种抑制作用主要来自于乳酸分子本身及其引起的培养基pH下降,而其引起的高渗透压则影响较小。另外,在成骨诱导实验过程中发现,乳酸(成骨诱导后期浓度在20 mmol/L以上时)能够抑制hAMSCs的成骨分化,这主要是由于乳酸分子本身及低pH环境能够通过阻遏转录因子Osterix基因的表达降低碱性磷酸酶活性和骨桥蛋白基因的表达,进而导致hAMSCs胞外钙结节的减少。进一步研究还发现,高浓度乳酸对hAMSCs成骨分化的抑制作用可能与此浓度下乳酸促进hAMSCs向成脂肪细胞分化有关。在BMMSCs的成骨诱导过程中高浓度乳酸对其成骨分化也有抑制作用,但与hAMSCs不同的是,乳酸对BMMSCs成骨分化的抑制作用不仅与乳酸分子本身有关,而且与乳酸引起的低pH和高渗透压(334mOsm/kg)环境也有关。另外,虽然在成骨诱导分化过程中乳酸对hAMSCs和BMMSCs的成骨分化具有抑制作用,但却在一定程度上促进了细胞增殖。最后,本文在认识了乳酸对hAMSCs扩增和成骨诱导分化影响的基础上,实验探索了hAMSCs在微载体和生物反应器系统中扩增时细胞的增殖特性以及氧环境和换液频率对hAMSCs扩增以及扩增后干细胞基因表达和维持成骨分化能力的影响,然后又以常规静态诱导作为对照,考察了hAMSCs在生物反应器微载体系统中的成骨诱导分化特性。研究发现,生物反应器微载体技术应用于hAMSCs规模化扩增和定向诱导比常规静态培养方式具有明显的优势。hAMSCs在生物反应器常氧环境下扩增时细胞密度可达6.88×105 cells/ml,远高于孔板静态扩增时的最高细胞密度(2.13×105 cells/ml)。在生物反应器中扩增hAMSCs时采用低氧条件,比常氧条件更有利于hAMSCs增殖、维持更高的干细胞基因Oct-4和Nanog基因表达水平以及其成骨分化潜能。然而,低氧条件下扩增细胞易产生大量的乳酸,通过每天换液可以降低培养基中的乳酸浓度,可望进一步优化生物反应器低氧扩增环境。实验发现,低氧环境下扩增每天换液较每1.5 d换液更有利于hAMSCs增殖及扩增后干细胞基因Oct-4的基因表达,但对成骨分化潜能的维持没有显著影响。另外,与常规静态诱导分化方式相比,在hAMSCs的成骨诱导分化过程中应用生物反应器微载体系统能够提高转录因子Runx2和Osterix基因的表达水平,进而促进其下游基因产物如Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨钙素等成骨特征蛋白的表达和胞外钙结节的形成。通过以上研究,本文对体外培养环境中代谢副产物乳酸影响hAMSCs体外扩增和成骨诱导分化的现象及其作用机制有了较为深入的认识,并初步建立了面向临床应用的生物反应器规模化扩增和成骨诱导分化技术。研究结果不但有助于理解体外培养环境与hAMSCs扩增和成骨诱导分化等生物学特性之间的有机联系,也有助于进一步认识体内微环境调控细胞增殖和分化的机制,为后续应用生物反应器微载体系统规模化扩增和定向诱导hAMSCs奠定了基础。