猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)是全球养猪业引起仔猪腹泻的主要病原之一,给养猪业造成较大的经济损失。我国断奶仔猪PoRV感染也较普遍,因此开展该病的病原分离等防控技术研究具有重要意义。本研究对2012年四川成都某猪场的疑似PoRV感染的腹泻病料进行RT-PCR检测,再进行了病原分离,成功分离获得一株轮状病毒,并对该病毒的病毒特性进行了研究。1.病毒的分离鉴定与特性将RT-PCR检测阳性的腹泻病料处理后接种到MA104细胞中,接毒中采用胰蛋白酶处理活化病毒的方法,60ug/ml胰酶敏化病毒液,并在维持液中使胰酶终浓度为6ug/ml。接毒后第一代便开始出现CPE,但不典型,到第三代时接毒第2天便开始出现CPE现象,出现死细胞,并且死细胞堆积到一块；第3天出现明显的病变特征,表现为细胞界限不清、圆缩、堆积呈菜花状,细胞开始脱落形成空泡区,直至第4天,大量的细胞死亡并脱落。将细胞分离病毒液连续传至22代,每隔3代进行PCR鉴定,结果扩增出预期大小的条带,表明分离出的病毒为PoRV,将其命名为SC-C。测定其TCID50表明病毒以10-7.57倍稀释后50ul接种细胞后可导致半数细胞死亡。理化性质鉴定表明,该分离毒株对乙醚和氯仿均不敏感,但将其置56℃水浴30min可将其灭活,证明其不耐热。2.VP7基因的克隆、测序与分析本研究根据GenBank中猪轮状病毒VP7全基因序列,设计一对特异引物,对分离株的VP7进行了全基因克隆测序与序列分析。结果表明VP7基因全长1061bp,编码326个氨基酸,核苷酸序列与推导的氨基酸序列长度与其它PoRV的VP7基因相同。将VP7序列同52株韩国分离的猪轮状病毒毒株比较,核苷酸序列和氨基酸序列同源性都在99%以上,表明PoRV的VP7序列相对较保守。将其同其它9株G5血清型毒株进行比对,核苷酸序列同源性为87.4%-99.8%,氨基酸序列同源性也高达92.6%-99.7%,而同其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均较低,由此可推断出,该分离株属于G5血清型。利用生物信息学软件VP7蛋白进行分析,其相对分子量为37.018KD,等电点为4.86,不稳定性系数为35.81,具有较强的稳定性,脂溶指数为95.06,总平均亲水性为0.072。该蛋白最大疏水指数为3.678,最小疏水指数为-2.400。预测VP7蛋白含有9个抗原位点,4-23位和32-54位存在2个跨膜区,推测此结构与VP7蛋白作为轮状病毒的主要中和抗原相关。PredicProtein预测该VP7蛋白二级结构中α-螺旋占30.67%,β-折叠占32.52%,β-转角占36.81%,其功能位点中包含1个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化作用位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点和3个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析表明VP7基因同国内东北分离到的一株A组猪轮状病毒(JL94)亲缘性最近,其次与牛源A组轮状病毒具有较近进化距离。3.病毒回归试验取3.75×106PFU/ml细胞分离PoRV病毒液感染4日龄乳猪进行动物回归试验,人工感染乳猪表现为感染3h后四处走动、步态不稳、拱背腹痛症状、呼吸急促,频率为70次/min,到第5天出现腹泻症状,呈黄色水样腹泻。剖检可见各肠段胀气明显,十二指肠肠壁变薄,空肠明显充血,可见明显的出血点。肠系膜出现严重充血且肠系膜淋巴结肿大。取十二指肠,空肠,回肠,结肠段进行RT-PCR检测,均可见预期大小的条带片段,由此可知各肠段均有PoRV感染。取感染猪肠及内容物接种于MA104细胞,可在第四天观察到轻微的细胞病变,血清中和实验表明1：23.47倍稀释的标准PoRV阳性血清能中和该病毒的致细胞病变作用。间接ELISA检测感染后血清IgG可知乳猪口服病毒后产生较高滴度的IgG抗体水平,口服灭活病毒产生的抗体水平高于口服活病毒所产生的抗体水平,且每7d免疫能更好的诱导乳猪产生IgG抗体,并在21d时抗体水平达到最高。本试验成功分离得到了一株轮状病毒四川毒株,并对其VP7基因进行克隆测序和分析。将其对4日龄的乳猪进行再感染试验,以探索其致病性。本研究为猪轮状病毒的诊断方法和致病机制的深入研究奠定了基础。