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研究目的：胰岛β细胞的功能失调是导致糖尿病病理过程的核心原因。miRNAs是当今生物学最令人鼓舞和最富有成果的研究领域,并且作为一个新的因子参与糖尿病及其并发症的病理过程。miRNA在糖尿病中的生理作用最早可以追溯到胰岛的发育时期。最近,许多研究报道miRNAs在糖尿病的各个方面起着重要的作用。FGF-21促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取,在FGF-21转基因动物中,FGF-21抑制了食物诱导的肥胖,在糖尿病的动物中给予FGF-21可以降低其血糖和甘油三酯的水平,这是治疗糖尿病的一个好方法。但FGF-21是在何种生物因子调控下发挥这些作用的,目前还不清楚,国内外在此方面的研究较少。通过生物信息学的方法我们预测出FGF-21是miR-577的直接靶标基因,那么,miR-577能否通过FGF-21影响胰岛β细胞的胰岛素分泌,miR-577调控FGF-21的具体机制是什么,目前国内外的研究较少。因此,本研究旨在通过在β细胞中确定miR-577与FGF-21的关系,以及研究miR-577在胰岛β细胞中的功能及作用机制,探索miR-577在糖尿病中的作用,期望为更好地理解糖尿病的发病机制,为糖尿病的临床诊断治疗提供实验室依据。研究方法：1.通过生物信息学的方法预测出FGF-21是miR-577的直接靶标基因。利用过表达miR-577和抑制miR-577这两种方式去验证我们的结果：(1)构建野生型及突变型FGF-21的3’端非编码区荧光素酶检测载体质粒,用这两种质粒分别和miR-577或者阴性对照(miR-control)的寡聚核苷酸同时转染293T细胞(miR-577组和miR-control组),48小时后利用荧光素酶报告基因法测定细胞的荧光素酶强度。(2)构建miR-577过表达的慢病毒(LV-miR-577)和空白对照病毒(miR-control),用这两种病毒分别感染小鼠胚胎原代β细胞(EPB)和INS-1小鼠胰腺癌β细胞系(INS-1),分为miR-577组和miR-control组,48小时后抽取细胞RNA进行实时定量PCR检测FGF-21的信使RNA水平。(3)用同样方法感染上述两种细胞,同样分为miR-577组和miR-control组,48小时后收集细胞上清,利用酶联免疫法检测上清中FGF-21的水平。2.利用胰岛素分泌实验检测miR-577是否通过靶标FGF-21参与调节胰岛素的分泌：(1)利用LV-miR-577或者阴性对照LV-miR-control感染EPB细胞,用50nmol/1的FGF-21刺激感染后的EPB细胞(miR-577+FGF-21组和miR-control+FGF-21组)和未感染的EPB细胞(FGF-21组),在刺激后的0、24和48小时三个不同的时间点再用15mmol/1的葡萄糖刺激90分钟后,利用酶联免疫吸附法检测胰岛素含量。(2)与上述同样的方法及分组,在FGF-21刺激后的0小时及24小时,用15mmol/1的葡萄糖刺激三组细胞90分钟后,收集细胞RNA,然后利用实时定量PCR的方法检测胰岛素基因的信使RNA表达水平。(3)利用50nmol/1的FGF-21刺激LV-miR-577或者阴性对照LV-miR-control感染的EPB细胞,分为miR-577+FGF-21组和miR-control+FGF-21组,在刺激后的0、4、8、12、24、48和72小时,七个不同的时间点,再用15mmol/1的葡萄糖刺激细胞90分钟后检测胰岛素的蛋白表达水平,观察胰岛素分泌的动态变化。3.关于miR-577调控FGF-21的具体机制,我们利用蛋白印迹法(western bloting)和酶联免疫法在EPB细胞中检测miR-577是否调节FGF-21激活的下游信号通路：(1)利用LV-miR-577或者阴性对照LV-miR-control感染EPB细胞,用50nmol/1的FGF-21刺激感染后的EPB细胞及未感染的EPB细胞,分为miR-577+FGF-21组、miR-control组及FGF-21组,在刺激后的40,80和120分钟三个不同的时间点收集并裂解三组细胞,通过酶联免疫吸附法检测EPB细胞中ERK的磷酸化程度。(2)上述同样的方法作用于同样分组的三组细胞,收集并裂解细胞,提取蛋白,通过蛋白印迹法测定三组细胞的ERK磷酸化程度。结果：1.FGF-21是miR-577的直接靶标基因(1)在野生型FGF-21的3’端非编码区基因荧光素酶检测载体质粒转染的细胞中,miR-577组的荧光素酶强度较miR-control组明显降低(0.20±0.226vs0.60±0.234)(P<0.01)；在突变型FGF-21的3’端非编码区基因荧光素酶检测载体质粒转染的细胞中,二组的荧光素酶强度无明显差别(1.10±0.512vs1.00±0.326)(P>0.05)。(2)不论是在EPB细胞还是在INS-1细胞中,miR-577组的FGF-21的mRNA表达较miR-control组均明显减弱(0.38±0.345vs1.00±0.231；0.41±0.357vs1.02±0.523)(P均<0.01)。(3)不论是在EPB细胞还是在INS-1细胞中,miR-577组的FGF-21蛋白表达较miR-control组均明显减弱(350±10.87vs1210±50.01,420±20.95vs1550±61.56)(P<0.01)。2.miR-577通过负调控FGF-21抑制β细胞中胰岛素的分泌(1)在未用FGF-21刺激时(0小时),用葡萄糖刺激EPB细胞的胰岛素分泌后,miR-577+FGF-21组较FGF-21组及miR-control+FGF-21组的胰岛素的蛋白水平降低(0.286±0.026vs0.420±0.050,0.286±0.026vs0.410±0.049)但没有统计学意义(P均>0.05),miR-control+FGF-21组与FGF-21组无明显差异(0.410±0.049vs0.420±0.050)(P>0.05)。(2)在用FGF-21刺激后的24小时及48小时两个时间点,用葡萄糖刺激EPB细胞的分泌后,miR-577+FGF-21组的胰岛素蛋白水平较FGF-21组均明显降低(3.143±0.517vs6.850±0.523,3.132±0.265vs6.250±0.775)(P均<0.01)；与miR-control+FGF-21组相比,在两个时间点也均明显降低(3.143±0.517vs6.340±0.045,3.132±0.265vs6.139±0.052)(P均<0.01)；FGF-21组的胰岛素的蛋白水平在两个时间点与miR-control+FGF-21组均无明显差别(6.850±0.523vs6.340±0.045,6.250±0.775vs6.139±0.052)(P均>0.05)。(3)在未用FGF-21刺激时(0小时),用葡萄糖刺激EPB细胞的胰岛素分泌后,miR-577+FGF-21组较FGF-21组及miR-control+FGF-21组的胰岛素mRNA水平均降低(0.305±0.056vs0.616±0.035,0.305±0.056vs0.609±0.227),但没有统计学意义(P均>0.05),miR-control+FGF-21组与FGF-21组无明显差异(0.609±0.227vs0.616±0.035)(P>0.05)。(4)在用FGF-21刺激24小时后,用葡萄糖刺激EPB细胞的胰岛素分泌后,miR-577+FGF-21组的胰岛素mRNA水平较FGF-21组明显降低(0.795±0.156vs1.750±0.186)(P<0.01)；与miR-control+FGF-21组相比,也明显降低(0.795±0.156vs1.715±0.164)(P<0.01)；FGF-21组的胰岛素mRNA水平与miR-control+FGF-21组无差别(1.750±0.186vs1.715±0.164)(P>0.05)。(5)取过表达miR-577和miRNA-control的稳转EPB细胞,用FGF-21刺激细胞,分别在刺激后的0小时,4小时,8小时,12小时,24小时,48小时和72小时后,用葡萄糖刺激胰岛素分泌后90分钟,利用酶联免疫吸附测定的方法检测胰岛素的蛋白表达水平的动态变化,结果在FGF-21刺激后的8小时,胰岛素的表达水平达到最高点,以后随着时间的推移,胰岛素的表达水平逐渐下降,但直到72小时仍然处于相对平稳的水平。在各个时间点miR-577组的胰岛素蛋白表达水平均低于对照组。3.miR-577抑制FGF-21激活的FGF受体下游信号通路(1)通过酶联免疫吸附测定的方法检测ERK磷酸化的程度：miR-577+FGF-21组在40,80和120分钟三个不同的时间点均较FGF-21组和miR-control的ERK磷酸化程度低(0.14±0.123vs2.15±0.145,0.98±0.125vs1.62±0.214,0.83±1.785vs1.41±0.189)(P均<0.05)；(0.14±0.123vs2.14±0.256,0.98±0.125vs1.61±0.326,0.83±1.785vs1.42±0.212)P均<0.05)；而miR-control组和FGF-21组,在FGF-21刺激以后的上述时间点,ERK的磷酸化程度无明显差别(2.14±0.256vs2.15±0.145,1.61±0.326vs1.62±0.214,1.42±0.212vs1.41±0.189)(P均>0.05)。(2)通过western bloting检测ERK磷酸化程度：在未感染EPB细胞中(FGF-21组),在FGF-21刺激以后,ERK的磷酸化明显增强,在40分钟达到最高值,随着时间的延长磷酸化程度减弱。在miR-control组,在FGF-21刺激以后,ERK的磷酸化程度也明显增强,也是在40分钟达到最高值,随着时间的延长磷酸化程度减弱。而在miR-577过表达的EPB细胞中(miR-577+FGF-21组),在FGF-21刺激以后的上述几个时间点,ERK的磷酸化程度相对于FGF-21组和miR-control组均明显减弱。结论1.FGF-21是miR-577直接靶基因,miR-577可以调控FGF-21的表达。2.miR-577抑制FGF-21诱导的胰岛β细胞的胰岛素的分泌,抑制FGF-21的下游生物学作用。3.miR-577通过抑制胰岛β细胞中FGF-21激活的ERK信号通路,进而抑制FGF-21下游的生物学功能。总之,我们的数据表明miR-577是FGF-21的一个新的调节分子,它通过FGF-21抑制了β细胞的胰岛素的分泌,并且抑制了FGF-21激活的下游信号ERK通路。通过研究我们发现了一个新的miRNA在糖尿病中具有重要作用,并且阐述了它的分子作用机制,为进一步治疗糖尿病提供了新的靶点。