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帕金森病( Parkinson’s disease, PD)是人类的一种中枢神经系统退行性疾病,主要病理变化表现为黑质多巴胺能神经元的损伤或进行性退化。传统的药物治疗方法,只能暂时缓解症状,不能彻底治愈,长期服用药物还会产生副作用。神经干细胞(NSCs)具有自我复制和多向分化潜能的特性,可以用来修复损伤的神经系统,移植神经干细胞对治疗帕金森病可能是一种理想的治疗方法。近年来,许多学者对通过神经干细胞移植方法治疗神经退行性疾病开展了探索性研究,并取得了一定的进展。本实验通过制作大鼠PD模型,研究神经干细胞的分离、培养、体外分化潜能,初步探讨NSCs移植治疗PD的可行性。研究内容与方法本研究以机械吹打法分离孕14天胎鼠中脑组织神经干细胞,制成单细胞悬液。将后者接种于含B27和bFGF的DMEM/F12无血清培养基中进行培养,观察神经干细胞的体外生长与增殖过程。通过巢蛋白(Nestin)的特异性显色,对原代及传代培养的神经干进行鉴定。以添加胎牛血清(FBS)和B27的DMEM培养基对NSCs进行诱导分化培养,证明体外培养NSCs的分化潜能。通过检测特异性的GFAP,鉴定星形胶质细胞;以检测特异性的NSE,鉴定神经元;以检测特异性TH鉴定多巴胺神经元。6-羟多巴胺(6-OHDA)是一种神经毒素,能竞争性的损坏多巴胺神经元。本实验以立体定位法单侧纹状体内注射6-OHDA建立大鼠PD模型,以下面两种方法对其模型进行评价:①阿扑吗啡(APO)诱导大鼠旋转试验,旋转圈数≥7r/min者视为成功PD模型。②免疫组织化学的方法对黑质多巴胺神经元形态学观察对模型进行评价。采用立体定位法向PD模型大鼠纹状体内移植NSCs,以行为学检测初步探讨NSCs移植对PD模型鼠的治疗情况。结果以机械分离法得到的NSCs平均存活率为89.14%;刚分离的细胞呈圆形,体积较大,边界清楚,折光性强,细胞光滑无突起,接种后3天,可形成典型的神经球,大小不一;培养6天后传代,本实验已传至2代,传代后培养6天左右神经球再次达到100-200个细胞,神经球形成方式、形成时间及形态与原代培养相似,经Nestin鉴定呈阳性,证明神经干细胞具有增殖能力。NSCs在分化培养基中培养36h,神经球周围伸出多个突起;培养7天后,相邻干细胞球迁出的细胞相互交联。迁出的细胞从形态上看既有神经元,又有神经胶质细胞,经免疫细胞化学鉴定,分化的细胞有的呈GFAP阳性,为星形胶质细胞;有的呈NSE阳性,为神经元;此外,NSCs还能分化为呈TH阳性的多巴胺神经元。说明NSCs具有分化潜能,在体外可以分化为多巴胺神经元,为NSCs脑内移植分化为多巴胺神经元治疗PD提供依据。以6-OHDA纹状体内注射制作大鼠PD模型,术后2周经APO诱导,大鼠出现明显的旋转,随后缓慢上升,至术后5周升至较高的水平并保持平稳,模型稳定,成功率达62.1%;并且模型鼠在术后8个月经诱导,仍可发生旋转行为,为以后细胞移植治疗诸多神经退行性疾病提供可靠稳定的动物模型。在本实验中,将体外培养的NSCs向纹状体内移植后,经行为学检测,初步证明纹状体内移植NSCs可以改善PD症状。