细胞凋亡是多细胞生物清除多余、感染、损伤或有潜在危险细胞的一种主要生理机制。蛋白水解酶是细胞凋亡研究的重要方向,而其中大部分工作都集中在探索Caspases的功能和调控上。Caspases家族成员或作为凋亡启动者诱导凋亡发生,或作为凋亡执行者切割重要的功能和结构蛋白分子,最终导致细胞死亡。然而近年来,越来越多的证据显示一些非Caspsase蛋白酶如位于溶酶体中的Cathepsins特别是Cathepsin B (CTSB)参与细胞凋亡过程。Cathepsins既可以与Caspases协同作用,也可以不依赖于Caspases独立执行凋亡作用。Cathepsins介导凋亡途径的细胞特异性很明显,目前对其调控机制依旧了解很少。肿瘤坏死因子(TNFa)是一种多功能的细胞因子,其细胞毒性作用非常重要,很大程度上是由其介导的细胞凋亡所实现的。TNFa既可以通过激活Caspase-8引发经典线粒体凋亡途径进而激活下游Caspase-3,-6,-7等凋亡执行蛋白酶引发凋亡表型,也可以诱导溶酶体释放CTSB等溶酶体蛋白酶进入胞浆,激活溶酶体凋亡途径,导致细胞死亡。尽管CTSB参与介导细胞凋亡过程已被一系列研究证实,其相关调控机制仍有许多未解之谜。我们以卵巢癌OV-90细胞株作为对象,针对TNFa诱导的OV-90细胞凋亡通路中CTSB与Caspases所扮演的角色和相互关系进行研究。主要研究结果如下：(1).证实CTSB与Caspases均参与TNFa诱导的OV-90细胞凋亡过程,而溶酶体蛋白酶Cathepsin D则对TNFa诱导的OV-90细胞凋亡影响很小。Caspases的激活和线粒体结构变化要早于CTSB活化和溶酶体结构变化。(2).OV-90细胞中存在TNFα→Caspase-8→Bid→Mitochondria→Cytochrome c→Caspase-9→Caspase-3,-6→Apoptosis这一经典凋亡信号途径。一旦Caspase-8的活性被其特异性抑制剂z-IETD-fmk (IETD)抑制,后面一系列反应全部被明显抑制。Granzyme B也参与TNFa诱导的OV-90细胞凋亡过程,相对位于Caspase-8下游,对于Caspase-3,-6激活具有影响。同时,Caspase-3对上游Caspases等具有一定的反馈激活作用。(3). CTSB参与由TNFa激活的OV-90细胞Caspases经典凋亡途径。Caspase-8位于CTSB的相对上游位置,影响CTSB从溶酶体向胞浆中的释放和激活。在CTSB特异性抑制剂CA074Me(CA)的作用下,线粒体释放Cytochrome C以及Caspase-3激活都会受到明显抑制,Caspase-8的活性也会降低,说明CTSB可以通过线粒体途径影响OV-90细胞凋亡,而且对Caspase-8具有一定的反馈激活作用。(4).在TNFa诱导的OV-90细胞凋亡中,对Caspase-8的抑制会减少但并不会完全阻碍溶酶体膜渗漏和CTSB从溶酶体向胞浆中的释放,CTSB特异性抑制剂CA也可以降低溶酶体渗漏程度,这说明Caspase-8和CTSB均参与了TNFa诱导的OV-90细胞溶酶体膜通透性的改变。同时,CA和Caspases广谱抑制剂zVAD-fmk对OV-90细胞凋亡抑制的协同作用证明CTSB参与的凋亡途径与Caspases途径并不完全重合,CTSB可能参与其他非Caspases依赖的凋亡途径。(5).研究发现一般作为线粒体膜稳定剂发挥作用从而抑制线粒体介导的细胞凋亡的cyclosporin A (CsA)与TNFa共同使用时,可以促进TNFa诱导的OV-90细胞凋亡,而CsA单独处理对OV-90细胞没有毒性。CsA与Caspase-8特异性抑制剂IETD共同作用对细胞凋亡的抑制作用强于IETD单独作用效应；与此相反,CsA与CTSB特异性抑制剂CA共同作用对细胞凋亡的抑制作用弱于CA单独作用效应。相关研究结果进一步提示OV-90细胞凋亡途径中CTSB和Caspase-8存在不同的作用机制,CTSB参与的凋亡途径并不完全依赖于Caspase-8本文的研究结果为阐明TNFa诱导OV-90细胞凋亡机制以及溶酶体CTSB在其中的作用奠定了一定的基础。