传统观念认为心肌细胞是一种终末分化细胞,当心肌细胞发生缺血时,早期心肌细胞大量坏死,心脏收缩功能减退；后期坏死心肌被纤维结缔组织所替代,非缺血区域心肌离心性肥厚进一步导致心肌功能降低。冠状动脉血供的重建是治疗心肌梗死最有效和最根本的方式,而近年来新兴的细胞移植技术,开拓了治疗心肌梗死一种新的途径。本文探讨细胞介导的血管生成正是通过移植细胞促进缺血区血运重建来改善心功能及心肌梗死预后。我们研究目的是证实脐血中单个核细胞(mononuclear cells, MNCs)通过适当培养条件可以分化形成具有内皮细胞特征的细胞即内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs),移植进入具有心肌梗死的裸鼠体内中,利用裸鼠的免疫缺陷,观察人脐血EPCs对梗死区域新生血管的影响,探讨人脐静脉血EPCs移植治疗裸鼠心肌梗死的有效性。第一部分人哜血单个核细胞的诱导培养及内皮祖细胞特性的观察目的：研究从新鲜人脐静脉血中提取并分离单个核细胞,在体外培养并加入诱导剂进行诱导分化,并对此类细胞进行鉴定证实此类细胞为内皮祖细胞。方法：1.人脐静脉血的采取：经产妇及其家属同意,随机选取5例足月行剖腹产的健康产妇作为脐血采取对象。预先将肝素与生理盐水配制成浓度为50u/ml,待胎盘剥离后无菌条件下立即用4ml肝素抗凝的注射器采集脐静脉血。采血量40ml,充分摇匀后待分离,2小时内处理。2.脐血单个核细胞分离：脐血与DMEM培养基1：1稀释。取稀释后脐血小心平铺于等体积的Bioshop淋巴细胞分离液上,于2000 r/min下离心20min。离心后管内分为三层,上层为血浆,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带。吸取单个核细胞,加入5倍以上体积的无血清DMEM,于1500r/m下离心10分钟,洗涤细胞一次。3.诱导条件：应用DMEM培养基和20%胎牛血清,其内添加血管内皮生长因子(VEGF165,20ng/ml),碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF, 1ng/ml),胰岛素样生长因子-1(IGF-1,2ng/ml),谷氨酰胺(300μg/ml),青霉素G(100U/ml)和链霉素(100mg/L)。接种于明胶包被的6孔培养板,接种密度5×105/ml。第3日开始第一次换液,以后每2-3日换液一次,换液前于倒置显微镜下观察并记录细胞形态学改变。4.检测指标：贴壁细胞在培养7日时,细胞在含DiI-acLDL(10μg/mL)的培养液中37℃避光孵育4h,然后以4%的中性甲醛固定10min,PBS液漂洗后加FITC-UEA-1 (10μg/mL)避光孵育1h。PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察细胞荧光染色,FITC-UEA-1和Dil-acLDL两种染色阳性细胞为正在分化的EPCs。用流式细胞仪检测培养7日后贴壁细胞CD34+及CD133+的阳性率。用RT-PCR研究培养细胞内是否存在VEGFR-2 mRNA。结果：1.EPC细胞形态改变：密度梯度离心法分离的MNCs经台盼蓝染色计算活细胞百分率达95%以上。MNCs经过上述条件培养后,在显微镜下观察细胞的生长特性。MNCs呈圆形,均匀地悬浮分布。3日后弃去非贴壁细胞,可见少量梭形细胞出现。培养早期可见圆形细胞类似于白细胞,但培养7日后圆形细胞明显减少并出现小集落。培养贴壁细胞1周后可见细胞呈现梭形或1-3个多突起细胞。高倍镜下这些细胞细胞核较大,部分细胞可见分裂相。2周左右小集落逐渐形成典型集落。3周左右集落间相互融合,梭形细胞逐渐缩短,并出现内皮细胞的典型“铺路石”样改变。2.流式细胞仪检测：取第7日贴壁细胞进行流式细胞仪检测,CD34和CD133阳性率分别为(50.48±5.17)%和(19.12±4.37)%。3.荧光显微镜检测：超过90%的贴壁细胞能够摄取DiI-acLDL和FITC-UEA-1。4. RT-PCR检测：RT-PCR提示分离培养的贴壁细胞有VEGF receptor-2扩增产物。结论：我们应用梯度离心法分离脐血单个核细胞,接种于明胶包被的塑料培养板,在有VEGF, bFGF和IGF-1存在的条件下培养。虽然在接种早期这些细胞仍混有造血细胞、内皮细胞等,但进一步培养诱导可以获得较纯的EPCs细胞。EPCs有许多表面分子,本实验中应用国际常用的EPCs鉴定指标,对从脐血中诱导分化的细胞进行鉴定。其中流式细胞仪鉴定显示诱导7日后细胞CD34阳性率达(50.48±5.17)%,CDl 33阳性率达(19.12±4.37)%,90%以上的贴壁细胞两种荧光染色阳性,并且能表达VEGFR-2。以上均提示,该方法能简捷快速诱导脐血中的MNCs分化为EPCs。第二部分人脐静脉瞧内皮祖细胞移植于心肌梗死裸鼠的实验研究目的：人脐静脉血的EPCs具有免疫功能尚不成熟,其免疫原性弱,移植物抗宿主病发生率低,以及移植后对HLA位点不合耐受性高等特点。将人脐静脉血单个核细胞在体外培养7日后的贴壁细胞作为内皮祖细胞进行移植于建立裸鼠的心肌梗死模型中,利用裸鼠的免疫缺陷,观察人脐血内皮祖细胞对裸鼠心肌梗死面积以及梗死区域新生血管影响,探讨该细胞移植治疗缺血性心脏病的有效性和可能性。方法：1.分组：雌性BALB/c-nu裸鼠20只,随机分成实验组和对照组(n=10)。2.动物模型的建立：腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,每只0.05ml,效果欠佳者追加0.02ml。连接16通道生理记录仪(PowerLab,澳大利亚ADInstruments公司),记录心电图。胸骨上正中线处切开皮肤长约0.5cm,游离气管并切开后用24G静脉留置针插管,小动物呼吸机(DH-150,浙江大学产)维持,定容模式,呼吸频率90次/min,潮气量为3-6ml,吸气：呼气比为1：1,出现胸廓抬举及透过皮肤可见双肺扩张良好表明气管插管成功。胸部正中纵行切开约1cm打开胸腔,用止血钳牵拉胸壁以暴露心脏。用无齿镊轻轻固定心脏,在动脉圆椎与左心耳之间以7-0 Prolene线结扎左冠状动脉,然后观察左室颜色改变,并记录心电图改变。结扎后出现左室变白,心电图出现ST段抬高即为结扎成功,关闭胸腔时将潮气量稍微调大。3.处理方法：将培养7日后的贴壁细胞于含CM-Dil(2μg/mL)的培养液中37℃避光孵育5min,然后置于4℃冰箱内孵育15mmin后搜集细胞并离心浓度为107/ml待用。实验组于尾静脉注射0.3ml浓度为107/ml预先离心好并标记CM-Dil的EPCs,对照组直接注射DMEM培养基。4.实验结果的观察：术后2周后处死裸鼠,心脏于液氮冻存30min后取长轴垂直方向1-2mm厚切片,以TTC染色法计算心肌梗死面积。其余标本行冰冻切片(厚度5μm),于荧光显微镜下观察冰冻切片心肌梗死部位新生毛细血管的荧光。光学显微镜下观察实验组及对照组心肌梗死部位的组织学改变。每张切片在高倍视野(×200)下在梗死交界区随机取5个视野,计算每张切片的平均毛细血管数。结果：术后2周实验组存活7只,对照组存活6只,全组实验中心肌梗死模型存活率为65%。1.心肌梗死面积：术后2周处死裸鼠后,心肌梗死区域病理切片可见毛细血管和成纤维细胞的生长；计算心肌梗死面积,实验组平均梗死面积为(8.27±1.64)%,对照组为(14.30±2.84)%,两组差异有统计学意义(t=-4.78,P=0.001)。2.毛细血管密度：术后2周计数毛细血管密度,实验组每高倍视野平均新生血管密度为14.29±1.38,对照组为10.17±1.72,两组差异有统计学意义(t=4.79，P=0.001)。3.梗死区新生血管荧光：术后2周处死裸鼠后,荧光显微镜下观察可见实验组新生血管处有呈管状分布的红色荧光,而对照组为阴性。结论：裸鼠体积较小,无论直接或者间接测定其心脏功能均较困难,本实验采用EPCs移植后心肌梗死面积的改变及毛细血管密度的变化,判断移植在缺血性心脏病治疗中的可能性及有效性。本组实验中实验组平均梗死面积小于对照组,而毛细血管密度高于对照组,差异有统计学意义。另外,CM-Dil常用来作为荧光示踪剂,本实验中将摄取有CM-Dil的EPCs细胞移植到裸鼠体内,两周后在荧光显微镜下观察新生血管可见红色荧光,证实新生毛细血管中有EPCs参与。EPCs移植对于心脏功能有益影响的确切机制尚待进一步的证实,可能是通过特异性生成新生血管组织,分化成为成熟内皮细胞或者通过分泌各种促血管生长因子促进宿主自体心肌内血管生成,重建梗死区血运。本研究建立裸鼠心肌梗死模型,观察了人脐静脉血单个核细胞在体外诱导分化为内皮祖细胞后移植对心肌梗死后心肌缺血部位的改变,研究证实该方法可减少心肌梗死面积,明显增加心肌梗死区域的毛细血管再生。间接证实脐血内皮祖细胞移植对心肌缺血具有治疗作用。