论文部分内容阅读
研究背景及目的:目前临床显示西妥昔单抗治疗KRAS突变的大肠癌疗效甚微。有研究显示西妥昔单抗可诱导免疫原性细胞死亡而发挥抑制肿瘤生长的作用,但是此效果收效欠佳,可能与肿瘤本身有限制免疫原性细胞死亡的因素有关,从而导致西妥昔单抗诱导肿瘤细胞免疫原性死亡能力有限,减弱其抑制肿瘤生长的效力。因此找寻限制KRAS突变大肠癌免疫原性死亡的因素,有利于解决临床西妥昔单抗治疗KRAS突变大肠癌疗效差的困境。在肿瘤微环境中,免疫细胞的不同活化状态直接决定肿瘤周围免疫属性,决定肿瘤细胞走向免疫原性死亡还是出现免疫逃逸。其中肿瘤相关巨噬细胞活化为M2型巨噬细胞就是有效改变肿瘤微环境中的免疫属性,帮助肿瘤细胞逃脱机体的免疫杀伤的关键。文献报道GRP78是调节肿瘤细胞的关键因素,其可通过糖酵解信号通路调节巨噬细胞向M2型巨噬细胞活化,并且其在多种肿瘤分泌的外泌体（Exosome,EXOs）中被检测到,具有从肿瘤细胞中转运至巨噬细胞中的有利条件。GRP78在肿瘤中发生位置的转位与其蛋白翻译后修饰有关。在我们前期研究中显示催化精氨酸单ADP核糖基化修饰的酶ART1在大肠癌组织中表达较肠黏膜增高,并在KRAS突变型大肠癌LOVO（KRASG13D,A14V）细胞以及CT26（KRASG12D）细胞均有表达,抑制LOVO（KRASG13D,A14V）细胞和CT26（KRASG12D）细胞中ART1的水平可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,促进肿瘤细胞的凋亡水平。同时有研究发现ART1可以催化GRP78 R470和R492发生单ADP核糖基化修饰。这让我们推测:在KRAS突变的大肠癌中,ART1可通过催化GRP78发生单ADP核糖基化修饰,从而促进GRP78包裹入大肠癌细胞外泌体中并释放至肿瘤微环境,抑制巨噬细胞糖酵解相关通路,导致M2型巨噬细胞活化增加,抑制免疫原性细胞死亡,抵抗西妥昔单抗对KRAS突变的大肠癌发挥疗效。此研究有利于为KRAS突变大肠癌患者找到限制西妥昔单抗药物发挥效应的因素,解决KRAS突变大肠癌靶向药物疗效欠佳现状提供新的方向及初步的实验依据。方法:1.KRAS突变大肠癌中ART1表达与M2型巨噬细胞活化的相关性（1）KRAS突变（KRAS mutation,KRAS MUT）和KRAS野生型（KRAS wild type,KRAS WT）大肠癌组织中M2型巨噬细胞分布和ART1表达及相关性采用免疫组化检测KRAS MUT大肠癌组织和KRAS WT大肠癌组织中巨噬细胞的指标蛋白CD68和M2型巨噬细胞标志蛋白CD163、CD206与ART1的蛋白表达并分析之间相关性。（2）KRAS MUT和KRAS WT大肠癌细胞系对M2型巨噬细胞活化诱导的影响LOVO细胞（KRASG13D,A14V）、SW480细胞（KRASG12V）、CT26细胞（KRASG12D）和HT-29（KRAS WT）、MC38（KRAS WT）分别与人源THP-1或鼠源RAW264.7巨噬细胞共培养,观察M2型巨噬细胞活化情况,流式细胞术检测CD68和CD206的共表达M2型巨噬细胞,确认M2型巨噬细胞诱导情况。（3）敲减KRAS MUT大肠癌CT26细胞ART1对M2型巨噬细胞活化诱导的影响敲减CT26细胞（KRASG12D）ART1后,将ART1敲减、未转染、空载的CT26细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养,流式细胞术检测CD68和CD206的共表达M2型巨噬细胞。（4）ART1敲减对大肠癌小鼠皮下移植瘤组织中M2型巨噬细胞分布的影响敲减CT26细胞（KRASG12D）ART1后,将ART1敲减、未转染、空载的CT26细胞皮下接种于BALB/C小鼠构建移植瘤,将瘤体组织固定、包埋、切片后,免疫组化检测移植瘤组织中M2型巨噬细胞分布情况。2.KRAS MUT大肠癌中ART1调节M2型巨噬细胞活化的分子机制（1）外泌体（Exosomes,EXOs）的提取和鉴定提取ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞中的外泌体,用电镜和WB实验鉴定外泌体,用NTA法鉴定检测外泌体的浓度及粒径分布。（2）MIBG抑制ART1对外泌体GRP78含量的影响。激光扫描共聚焦显微镜检测MIBG抑制ART1后与外泌体共定位的GRP78蛋白水平。（3）ART1对KRAS突变大肠癌细胞系外泌体GRP78含量的影响用酶联免疫吸附法检测ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞上清液中GRP78的水平,Western Blot实验检测ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞外泌体中GRP78的含量,激光扫描共聚焦显微镜检测ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞中与外泌体共定位的GRP78蛋白水平。（4）ART1干扰外泌体GRP78通过糖酵解信号通路调节M2型巨噬细胞的活化提取ART1敲减、空载和未转染的KRAS突变大肠癌CT26细胞的外泌体与RAW264.7巨噬细胞共培养24小时后进行分析。Western blot和细胞免疫荧光实验分别检测巨噬细胞中糖酵解信号通路蛋白TLR4、PKM2、HIF-1ɑ和ROS水平。（5）ART1干扰外泌体GRP78对M2型巨噬细胞分泌IL-10和TGF-β水平的影响敲减CT26细胞中ART1后,提取ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞分泌的外泌体与RAW264.7巨噬细胞共培养24小时后,收集巨噬细胞上清液用酶联免疫吸附法检测巨噬细胞分泌的IL-10和TGF-β的水平。3.ART1调节M2型巨噬细胞活化参与辅助西妥昔单抗治疗KRAS突变大肠癌细胞（1）ART1敲减的CT26细胞对药物处理后细胞增殖能力的影响用西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理或联合处理ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养体系,采用EDU实验检测肿瘤细胞增殖情况。（2）ART1敲减的CT26细胞对药物处理后细胞侵袭能力的影响用西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理或联合处理ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养体系。Transewell检测肿瘤细胞侵袭能力。（3）ART1敲减对西妥昔单抗处理后大肠癌皮下移植瘤生长的影响敲减CT26细胞ART1后,将ART1敲减、空载和未转染组CT26细胞皮下接种BALB/C小鼠构建移植瘤,并分别注射西妥昔单抗处理,观察成瘤及移植瘤生长速度、大小及重量。（4）西妥昔单抗处理对ART1敲减大肠癌皮下移植瘤增殖相关指数的影响将瘤体组织固定、包埋、切片,然后进行HE染色检测移植瘤组织中核分裂象及免疫组化检测增殖指数Ki67表达情况。结果:1.KRAS突变大肠癌ART1表达与M2型巨噬细胞活化的相关性（1）KRAS MUT和KRAS WT大肠癌组织中M2型巨噬细胞分布和ART1表达及相关性免疫组化结果CD68+阳性的巨噬细胞,CD163+与CD206+的M2型巨噬细胞在KRAS MUT大肠癌组织中的数量明显高于KRAS WT组织（P<0.05）。KRAS MUT组织中ART1表达的阳性程度明显高于KRAS WT组织（P<0.05）。20例KRAS MUT大肠癌组织中,CD68+的巨噬细胞和CD163+、CD206+的M2型巨噬细胞数量与ART1表达的阳性程度呈正相关性（P<0.05）。（2）KRAS MUT和KRAS WT大肠癌细胞系对M2型巨噬细胞活化诱导的影响分别用KRAS MUT和KRAS WT的大肠癌细胞与巨噬细胞共培养,用流式细胞术检测CD206和CD68共表达的M2型巨噬细胞。结果表明,KRAS MUT的LOVO、SW480和CT26细胞对M2型巨噬细胞的诱导高于KRAS WT的HT29和MC38细胞（P<0.05）。（3）敲减KRAS MUT大肠癌细胞CT26细胞中ART1对M2型巨噬细胞活化诱导的影响用ART1敲减、未转染、空载CT26细胞与巨噬细胞共培养,用流式细胞术检测CD206和CD68共表达的M2型巨噬细胞。结果表明,ART1敲减后对M2巨噬细胞活化的诱导明显低于ART1未转染组和ART1空载组（P<0.05）,ART1未转染组和ART1空载组对M2型巨噬细胞活化的诱导差别无统计学意义（P>0.05）。（4）ART1敲减对大肠癌小鼠皮下移植瘤组织中M2型巨噬细胞分布的影响处死小鼠取瘤之后,对瘤体组织固定、包埋、切片,将各组瘤组织切片进行M2型巨噬细胞标志蛋白CD206、CD163和巨噬细胞指标蛋白CD68免疫组化染色,结果表明,CD68+的巨噬细胞和CD163+、CD206+的M2型巨噬细胞在ART1-SH组大肠癌移植瘤组织中的数量明显低于ART1-WT和ART1-NC组瘤组织（P<0.05）,而CD68+的巨噬细胞和CD163+、CD206+的M2型巨噬细胞在ART1-WT和ART1-NC组大肠癌移植瘤组织中的数量差异无统计学意义（P>0.05）。2.KRAS MUT大肠癌ART1调节M2型巨噬细胞活化的分子机制（1）外泌体的提取和鉴定透射电镜和Western-Blot结果显示,从ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞上清液提取的物质,为纯度较高的外泌体。NTA检测得ART1-WT、ART1-NC、ART1-SH组外泌体的浓度分别为6+1014/L-1、3.2+1014/L-1、1.6+1014/L-1,大小均在80-150nm范围内。（2）MIBG抑制ART1对外泌体GRP78含量的影响使用MIBG抑制ART1,与未处理（ART1-WT）组比较,激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示对照ART1-WT组CT26细胞内GRP78和CD81（外泌体标志蛋白）存在显著共定位,而这种共同定位现象在使用MIBG之后减少;另外使用MIBG组与外泌体共定位的GRP78蛋白水平低于未处理组（P<0.05）。（3）ART1对KRAS突变大肠癌细胞系外泌体GRP78含量的影响提取ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞上清液进行ELISA检测,结果显示,ART1-SH组CT26细胞上清液中GRP78含量低于ART1-WT组和ART1-NC组（P<0.05）,ART1-WT组和ART1-NC组CT26细胞上清液中GRP78含量差别无统计学意义（P>0.05）;提取ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞上清液外泌体进行Western Blot实验,结果表明,GRP78蛋白表达水平在ART1-SH CT26组分泌的外泌体（EXOs-CT26SH）中低于ART1-WT CT26组分泌的外泌体（EXOs-CT26WT）和ART1-NC CT26组分泌的外泌体（EXOs-CT26NC）（P<0.05）,EXOs-CT26WT和EXOs-CT26NC组GRP78蛋白表达水平差别无统计学意义（P>0.05）;外泌体标志蛋白CD81标记为红色荧光,GRP78标记为绿色荧光,激光扫描共聚焦显微镜观察到,ART1-WT组和ART1-NC组CT26细胞内GRP78和CD81存在显著共定位,而这种共同定位现象在ART1敲减后减少;另外ART1-SH组与外泌体共定位的GRP78蛋白水平低于ART1-WT和ART1-NC组（P<0.05）,ART1-WT和ART1-NC组CT26细胞中与外泌体共定位的GRP78蛋白水平差别无统计学意义（P>0.05）。（4）ART1干扰外泌体GRP78通过糖酵解通路调节M2巨噬细胞的活化敲减CT26细胞中ART1后,提取ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞分泌的外泌体与RAW264.7细胞来源的巨噬细胞共培养24小时后,提取各组巨噬细胞蛋白进行Western Blot实验。结果表明,ART1敲减的CT26细胞和巨噬细胞共培养（M2-ART1 SH）组M2型巨噬细胞标志蛋白ARG1表达水平低于ART1未转染的CT26细胞和巨噬细胞共培养组（M2-ART1 WT）和ART1空载的CT26细胞和巨噬细胞共培养组（M2-ART1 NC）（P<0.05）,M2-ART1 WT组和M2-ART1 NC组M2巨噬细胞标志蛋白ARG1表达水平差别无统计学意义（P>0.05）。M2-ART1 SH组糖酵解信号通路指标TLR4、HIF-1ɑ、PKM2的表达水平高于M2-ART1 WT组和M2-ART1 NC组（P<0.05）,M2-ART1 WT组和M2-ART1 NC组糖酵解信号通路蛋白TLR4、HIF-1ɑ、PKM2的表达水平差别无统计学意义（P>0.05）。ROS的水平在M2-ART1 SH组高于M2-ART1 WT组和M2-ART1 NC组（P<0.05）,M2-ART1 WT组和M2-ART1 NC组ROS的水平差别无统计学意义（P>0.05）。（5）ART1干扰外泌体GRP78对M2型巨噬细胞分泌IL-10和TGF-β水平的影响敲减CT26细胞中ART1后,提取ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞分泌的外泌体与RAW264.7细胞来源的巨噬细胞共培养24小时后,收集巨噬细胞上清液用酶联免疫吸附法检测巨噬细胞分泌的IL-10和TGF-β的水平,结果表明,M2-ART1 SH组细胞上清液IL-10和TGF-β的水平低于M2-ART1 WT和M2-ART1 NC组（P<0.05）,M2-ART1 WT和M2-ART1 NC组细胞上清IL-10和TGF-β的水平差别无统计学意义（P>0.05）。3.ART1调节M2型巨噬细胞活化参与辅助西妥昔单抗治疗KRAS突变大肠癌细胞（1）ART1敲减的CT26细胞药物处理后对细胞增殖能力的影响用西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞和RAW264.7细胞共培养体系,用EDU法检查肿瘤细胞DNA的合成情况反映细胞的增殖能力。结果表明,与ART1未转染和空载组相比,不加药组、西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理的ART1-SH组CT26细胞DNA合成能力明显减弱（P<0.05）,而在ART1未转染和转染空载体CT26细胞之间DNA合成能力无显著差异（P>0.05）;与不加药组相比,西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理的ART1-SH CT26细胞组DNA合成能力明显减弱（P<0.05）,且联合用药组ART1-SH的CT26细胞DNA合成能力要低于单独用药组（P>0.05）。（2）ART1敲减的CT26细胞药物处理后对细胞侵袭能力的影响用西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理ART1敲减、空载、未转染的CT26细胞和RAW264.7细胞共培养体系,用Transewell实验检测细胞侵袭能力。结果表明,与ART1未转染和空载组相比,不加药组、西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理组的ART1-SH CT26细胞侵袭能力明显减弱（P<0.05）,而在ART1未转染和转染空载体CT26细胞之间细胞侵袭能力无显著差异（P>0.05）;与不加药组相比,西妥昔单抗、FOLFOX4方案分别处理和联合处理的ART1-SH CT26细胞组侵袭能力明显减弱（P<0.05）,且联合用药组ART1-SH CT26细胞侵袭能力要低于单独用药组（P>0.05）。（3）ART1敲减对西妥昔单抗处理后大肠癌皮下移植瘤生长的影响用西妥昔单抗处理后结果显示:ART1-SH组移植瘤生长大小和速度均低于ART1-WT组和ART1-NC组（P<0.05）,而ART1-WT组和ART1-NC组的移植瘤生长大小和速度差异无统计学意义（P>0.05）。ART1-SH组移植瘤体积和重量均低于ART1-WT组和ART1-NC（P<0.05）;ART1-WT组和ART1-NC组移植瘤的体积及重量差别无统计学意义（P>0.05）。（4）西妥昔单抗处理对ART1敲减大肠癌皮下移植瘤增殖相关指数的影响处死小鼠取瘤之后,对瘤体组织固定、包埋、切片,HE染色之后可见西妥昔单抗处理的ART1-SH组瘤组织肿瘤细胞中核分裂象数低于ART1-WT和ART1-NC组（P<0.05）,而西妥昔单抗处理的ART1-WT和ART1-NC组瘤组织肿瘤细胞核分裂象数差异无统计学意义（P>0.05）。将各组瘤组织切片进行Ki67免疫组化染色后,可见ART1-SH组Ki67阳性细胞百分率低于ART1-WT和ART1-NC组（P<0.05）,而ART1-WT和ART1-NC组Ki67阳性细胞百分率差别无统计学意义（P>0.05）。结论（1）通过离体实验和在体实验,显示M2型巨噬细胞数量和ART1表达在KRAS MUT大肠癌组织中均高于KRAS WT大肠癌组织,ART1参与了KRAS突变型大肠癌中调节M2型巨噬细胞活化过程;其调节机制与KRAS MUT大肠癌细胞中ART1干扰GRP78包裹进入肿瘤的外泌体中并被释放入肿瘤微环境,进而调节糖酵解信号通路诱导M2型巨噬细胞活化有关。（2）抑制KRAS MUT大肠癌细胞ART1诱导的M2型巨噬细胞活化可辅助西妥昔单抗抑制KRAS突变大肠癌细胞生长。详尽机制有待进一步研究。